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血研所2014年度各课题组进展情况
发布日期:2014-08-10 浏览次数:505

(一)白血病系统生物学(陈竺)
本课题组应用全基因组测序,首次报道了高危MDS患者造血干/祖细胞的遗传全景图,MDS分子标志基因突变谱以及新的预后分层体系的建立,为临床诊断和治疗提供了新的评判标准;对急性髓细胞白血病代谢组学的研究发现,AML患者的葡萄糖代谢发生了显著的紊乱,葡萄糖代谢水平是AML患者的一个独立预后因素;对Setd2基因的功能研究发现,该基因能够特异性的控制小鼠胚胎干细胞向内胚层细胞分化,为我们进一步探索SETD2在肿瘤发病过程中的作用提供了帮助。
1、骨髓增生异常综合征全基因组测序和基因突变谱预后分析
骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)是一组起源于造血干/祖细胞的高度异质性疾病,具有向急性白血病转化的高风险。我们应用高通量二代测序技术,对8例难治性贫血伴原始细胞增多型(Refractory anemia with excess blasts,RAEB)患者的CD34+造血干/祖细胞进行了全基因组测序,结果一共获得105个体细胞突变和96个突变基因。碱基突变谱的分析显示,MDS与AML具有相同的碱基置换、单碱基和三联碱基突变模式,为RAEB是“白血病前期”这一理论提供了直接客观的依据。对致病克隆的研究发现,在5例RAEB患者中,部分或全部存在于CD34+细胞中的突变并没有随细胞分化至下游成熟阶段,显示出MDS造血干/祖细胞增殖和分化的异质性。在扩大样本的研究中,我们分析了39个MDS分子标志基因在196例各类型MDS患者中的基因突变谱,至少检测到1个突变的患者占74.6%(145/196),突变比例在RAEB中远高于RCMD(91.0% vs. 55.8%),反映了RAEB具有较高的突变负荷,可能是RAEB患者临床预后差的一个重要原因。在与AML突变谱的比较中,我们发现MDS患者中活化信号分子以及NPM1、IDH1/IDH2的突变率远低于AML,而剪接体基因家族的突变率明显高于AML,揭示了两者在基因突变谱之间的异同点。最后,我们发现分子标志基因的突变具有临床预后价值,在此基础上,我们建立了依据分子标志(M-based)和IPSS-R-M两个预后分层体系,为临床诊断和分层治疗提供了新的依据。相关研究结果发表于《Proc Natl Acad Sci USA》。
2、葡萄糖代谢紊乱在急性髓系白血病中的预后价值
急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia, AML)是一组严重危害人类健康的血液系统肿瘤,既往的研究在染色体、基因和蛋白层面,发展了系列分子标志物对患者进行危险分层。然而,AML中染色体核型正常的患者约占50%,迫切需要发展新的分子标志物来完善危险分层体系。本研究运用气相色谱/飞行时间质谱平台对AML进行了代谢组学研究。通过分析400例AML患者和446例健康对照的血清代谢物,发现AML患者具有显著不同的代谢谱。通路分析显示葡萄糖代谢发生了明显紊乱,葡萄糖代谢水平是AML患者的一个独立预后因素,葡萄糖代谢活跃的患者其生存时间明显缩短。在葡萄糖代谢中发生显著紊乱的6个代谢物组成的葡萄糖代谢特征,在染色体核型正常的AML患者中具有预后价值。我们应用这6个代谢物标志建立了预后评分(prognosis-risk score,PRS)的判别方程式,发现低PRS能够独立预测患者的预后不良。我们进一步比较了高PRS组和低PRS组AML白血病细胞的表达谱,发现在代谢物判别方程式识别的AML高危患者即低PRS组,其糖酵解和TCA循环均增强。体外实验证实增强的糖酵解可引起AML细胞对化疗药阿糖胞苷(Ara-C)的敏感性降低,而抑制糖酵解可显著抑制AML细胞的增殖并且明显提高AML细胞对阿糖胞苷的敏感性。以上研究结果,为应用血清代谢物和代谢途径作为AML新的预后标志和潜在的治疗靶标提供了强有力的证据。相关研究成果发表于Blood》。
3、组蛋白H3K36三甲基化转移酶Setd2在小鼠胚胎干细胞分化过程中的功能及相关机制研究
SETD2基因是本课题组从人CD34+造血干/祖细胞文库中克隆到的一个基因,随后我们证实该基因能够特异性的催化组蛋白H3K36发生三甲基化。在体内,我们发现该基因的缺失可以引起小鼠胚胎血管发育缺陷。随着全基因组高通量测序技术的发展,一些研究发现该基因在多种肿瘤病人标本中存在异常突变,其中也包括白血病病人标本。然而,我们对于Setd2基因在正常细胞中的生物学功能仍然知之甚少。在本研究中,以小鼠胚胎干细胞为研究模型,我们发现Setd2基因能够特异性地控制小鼠胚胎干细胞向内胚层细胞分化。在对其机制的研究中,我们发现Setd2缺失的胚胎干细胞中Fgfr3基因表达下调,继而使得受Fgfr3调控的Erk信号传导途径受到明显影响。为了进一步研究Setd2是如何调控Fgfr3基因的表达,我们精确分析了H3K36三甲基化在Fgfr3基因各个区域的分布情况,结果发现Setd2主要通过影响Fgfr3基因远端启动子的H3K36三甲基化的修饰,继而调控Fgfr3的转录起始。这一新的基因表观遗传调控模式可以为我们探索SETD2在肿瘤发病过程中的作用提供帮助。相关的研究成果已发表于《Cell Reports》。
 
年度发表论文
1. Xu L, Gu ZH, Li Y, Zhang JL, Chang CK, Pan CM, Shi JY, Shen Y, Chen B, Wang YY, Jiang L, Lu J, Xu X, Tan JL, Chen Y, Wang SY, Li X, Chen Z, Chen SJ. Genomic landscape of CD34+ hematopoietic cells in myelodysplastic syndrome and gene mutation profiles as prognostic markers. Proc Natl Acad Sci USA 2014; 111:8589-8594.
2. Chen WL, Wang JH, Zhao AH, Xu X, Wang YH, Chen TL, Li JM, Mi JQ, Zhu YM, Liu YF, Wang YY, Jin J, Huang H, Wu DP, Li Y, Yan XJ, Yan JS, Li JY, Wang S, Huang XJ, Wang BS, Chen Z, Chen SJ, Jia W. A distinct glucose metabolism signature of acute myeloid leukemia with prognostic value. Blood 2014; 124:1645-1654.
3. Zhang YL, Xie SG, Zhou Y, Xie YY, Liu P, Sun MM, Xiao HS, Jin Y, Sun XJ, Chen Z, Huang QH, Chen SJ. H3K36 histone methyltransferase Setd2 is required for murine embryonic stem cell differentiation toward endoderm. Cell Rep 2014;8:1989-2002.
 
年度专利情况:
申请国内发明专利1项:《荚蒾乙素、其制备方法及用途》
专利号:201410407302.0
 
二、白血病发病原理研究(陈赛娟)
2014年本课题组主要致力于表观遗传相关基因DNMT3A突变和新的白血病受累基因IQCG在造血调控和白血病发病中的结构和功能的研究。揭示了DNMT3A-R882突变通过影响造血细胞的基因转录/DNA甲基化过程和细胞周期调控过程使小鼠诱发慢性粒单细胞白血病样的疾病表型。在斑马鱼模型揭示了IQCG激活下游钙离子信号通道可能的分子机制。此外,利用基因敲除小鼠模型发现Iqcg是小鼠精子鞭毛形成的必要基因。相关研究成果分别发表于2014年《Proc Natl Acad Sci USA》、《Nature Communications》和《Plos One》。
1.DNMT3A突变在白血病发病机制中的作用
DNA甲基转移酶3A(DNMT3A)基因是一个与表观遗传修饰相关的重要基因。我们实验室前期利用全外显子组测序技术,发现在急性单核细胞白血病中DNMT3A基因发生高频率突变并提示预后不良。为揭示DNMT3A突变对造血和白血病发病机制中的作用,我们将DNMT3A突变基因转导入小鼠造血干/祖细胞和细胞系,进行了体内、体外的功能研究。发现DNMT3A-R882H突变能增强造血细胞的增殖潜能,在向多系的分化能力上也具有较大的优势。骨髓移植6个月的R882H组小鼠的髓系祖细胞、LinSca-1+C-kit+(LSK)细胞群以及长程造血干细胞群(LinSca-1+C-kit+CD48CD150+)的比例明显增加,而其成熟粒细胞相对减少。在骨髓移植一年后的小鼠模型上,表现为DNMT3A-R882H能诱发慢性粒单细胞白血病样的疾病表型。通过表达谱芯片分析,发现与表达野生型DNMT3A或空载体的小鼠相比,DNMT3A突变的发病小鼠中一些造血相关基因表达明显异常,其中14个与长程造血干细胞亚群相关的基因上调,一批已知在白血病进展过程中被激活的基因被显著上调,如HOX家族基因和Idh1,粒细胞/单核细胞系分化的通路大部分被上调。为了从表观遗传调控水平揭示DNMT3A突变能引起基因组甲基化谱的改变,我们分选出移植一年后小鼠的骨髓GFP+细胞进行了甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)测序分析。有意思的是,发现大部分在DNMT3A-R882H组上调的造血相关基因如Hoxa3、Hoxa6、Idh1、Flt3和 Hlf,在gene body区域发生了低甲基化。提示DNMT3A-R882H的异常活性主要靶向的是Gene body区,通过异常的DNA甲基化模式来影响这些基因的转录表达。通过蛋白免疫沉淀、质谱鉴定和RNA干扰的方法,发现突变型DNMT3A-R882H与细胞周期重要蛋白CDK1的结合能力增强,DNMT3A-R882H突变能引起CDK1蛋白表达水平增加,并增强细胞周期活性。以上研究结果揭示了DNMT3A突变在白血病发病机制中所起的作用,也为该类白血病的诊治提供了新的分子标志物及潜在的药物靶标。相关研究成果发表于《Proc Natl Acad Sci USA》。
2.新的白血病受累基因IQCG在斑马鱼造血发育中的功能和机制研究
我们在前期的工作中克隆了一例急性白血病患者中新的融合基因 NUP98‐IQCG,其中IQCG是被首次发现与NUP98融合的受累基因,IQCG的结构和功能尚未被人们揭示。因此,我们利用斑马鱼模式动物研究了IQCG在造血发育中的作用和分子机制。研究发现,在iqcg敲低的斑马鱼胚胎中,造血干细胞以及下游分化的各系血细胞数量均下降。iqcg敲低的斑马鱼胚胎中,钙调素依赖的激酶IV(CaMKIV)活性下降,重新激活CaMKIV可以挽救iqcg缺失的造血表型。我们将斑马鱼camkIV敲低,能得到与iqcg敲低一致的表型。机制研究发现,IQCG能与钙调素(CaM)结合,作为CaMKIV的上游分子发挥功能。此外,我们利用表面等离子共振实验检测了IQCG与钙调素的作用强度,并解析了IQCG的IQ基序与钙调素的形成复合物的晶体结构。我们发现,在无钙离子条件下,IQCG与钙调素的结合力明显增强。另外,还发现与钙-钙调素结合力更高的CaMKIV,可以在HSP70的介导下与IQCG共定位。在无钙离子条件下,IQCG可以储存于钙调素蛋白;而在钙离子浓度升高时,IQCG则将钙-钙调素递交给与钙-钙调素结合力更强的CaMKIV,通过这样的模式来调控钙信号,进而影响了斑马鱼造血发育。综上所述,我们利用发育生物学的研究方法阐明了IQCG在斑马鱼定向造血发育中的重要功能和可能的下游分子,并结合分子生物学、生物化学和结构生物学的方法解释了IQCG激活下游信号的可能的分子机制。相关研究成果发表于《Nature Communications》。
3.发现Iqcg是小鼠精子鞭毛形成的必要基因
哺乳动物的精子发生由三个连续的过程构成:有丝分裂期,减数分裂期和精子形成。在精子形成过程中,圆形的精子细胞经历了显著的形态变化而成为成熟的精子,包括核固缩和延伸,顶体发育,鞭毛形成,多余胞质的去除。尽管这些转变在形态学水平有了很好的定义,但引起这些复杂过程的机制仍不清楚。我们的研究发现,Iqcg在小鼠精子发生过程中高表达,在精细胞发育过程中定位于精子领。Iqcg基因敲除的小鼠,由于精子形成严重缺陷和精子尾巴短缺而导致雄性小鼠不育。Iqcg敲除的精子鞭毛的基因丝是杂乱无章的,Iqcg敲除的精细胞中几乎没有典型(“9+2”)的微管排列模式。Iqcg在睾丸中以钙离子依赖的方式与钙调素发生相互作用,提示Iqcg可能通过钙信号通路发挥作用。此外,Iqcg敲除小鼠的气管和输卵管的纤毛结构,以及其他主要器官的组织形态,无明显变化。由此提示Iqcg是哺乳动物中特异性作用于精子形成的关键基因。这些结果也将为人类不育症的遗传学研究提供新的视角。相关研究成果发表于《Plos One》。
 
年度发表论文
1. Xu J, Wang YY, Dai YJ, Zhang W, Zhang WN, Xiong SM, Gu ZH, Wang KK, Zeng R, Chen Z, Chen SJ. DNMT3A Arg882 mutation drives chronic myelomonocytic leukemia through disturbing gene expression/DNA methylation in hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci USA 2014;111: 2620-2625.
2. Chen LT, Liang WX, Chen S, Li RK, Tan JL, Xu PF, Luo LF, Wang L, Yu SH, Meng GY, Li KK, Liu TX, Chen Z, Chen SJ.Functional and molecular features of the calmodulin-interacting protein IQCG required for haematopoiesis in zebrafish. Nat Commun 2014; 5:3811.
3. Li RK, Tan JL, Chen LT, Feng JS, Liang WX, Guo XJ, Liu P, Chen Z, Sha JH, Wang YF, Chen SJ. Iqcg is essential for sperm flagellum formation in mice. PLoS One 2014; 9:e98053.
 
三、造血细胞信号转导和白血病干细胞(诸江)
2014年度,“造血细胞信号转导和白血病干细胞实验室”在二个研究方向中取得进展。其一为“病毒RNA非活化状态的维甲酸诱导基因I(Rig-I)对造血干细胞稳态的维持作用及机制研究”。我们知道,在一个个体的一生中,造血干细胞(HSC)可能经历各种非生理情况(如炎症和DNA损伤),在此过程中及之后,HSC需通过调节其细胞周期、代谢和大分子修复机制以维持其干性和平衡的分化潜能,即所谓HSC的稳态。该稳态维持机制的异常可导致血液肿瘤或造血衰竭的发生,该研究为当代国际HSC研究的一个重要方面,目前相关机制的认知还很少。我们以为,在HSC稳态维持的核心机制中可能存在一些在多种不同应急情况下均发挥作用的关键调节分子。与此推断相符,在这项研究中,我们发现病毒RNA识别分子Rig-I在无病毒感染的情况下,在HSC应对辐照和化疗损伤等“应急”反应中发挥重要的作用。我们的结果显示,Rig-I-/- 小鼠HSC细胞周期静息状态被破坏,对5-FU处理、辐照及化疗的耐受性下降。在这些应急条件下,Rig-I-/- 小鼠HSC倾向髓系分化和凋亡。分子机制研究提示Rig-I是介导DDR(DNA damage response)的一个基本分子,其活性与病毒RNA活化的通路无关。其二为“白血病起始细胞(LIC)重塑造血微环境以促进白血病表型恶性进展”。 我们知道白血病起源于单个细胞的恶性转化生成LIC,在这方面,以往的研究着重于LIC的基本特征¾自我更新能力和长期生存,相信这二个特征是导致白血病恶性表型的充分和必要条件。但以往的研究忽视实际上体内原发的LIC(而不是体外白血病细胞系细胞)与正常干细胞一样,其自我更新能力和长期生存也依赖于造血微环境的支持作用。这样,在白血病恶性演进中,LIC与HSC始发的正常造血存在一争夺造血微环境资源的竞争。我们以一小鼠白血病同种系(syngeneic)移植模型对此问题进行了探讨。我们发现,在少量LIC输注正常小鼠体内后,白血病的表型的建立及正常造血的衰竭与一炎性骨髓微环境的出现有关。而炎性骨髓微环境的发生源于LIC本身的炎性特征。炎性造血微环境导致间充质干细胞分化受阻,后者干扰了正常造血干祖细胞的分化,但促进了LIC扩增。这些结果提示阻断LIC的致炎性机制可遏制白血病表型的发生和进展。
 
年度发表论文
Li XY, Jiang LJ, Chen L, Ding ML, Guo HZ, Zhang W, Zhang HX, Ma XD, Liu XD, Xi XD, Chen SJ, Chen Z, Zhu J. RIG-I modulates Src-mediated AKT activation to restrain leukemic stemness. Molecular Cell 2014; 53:407-19
 
四、实验血液学研究(赵维莅)
2014年课题组主要致力于恶性淋巴瘤疾病进展标志物和靶向治疗的研究。
自然杀伤/T细胞淋巴瘤(NKTCL)是一类CD56+/cytoCD3+的淋巴瘤,异质性强,侵袭性高,亚洲和南美多见。NKTCL分子发病机制尚未阐明。我们对25例NKTCL患者进行全外显子测序,并对80例患者进行扩大样本验证。其中71.4%的患者检测到体细胞突变,包括RNA解旋酶家族、抑癌基因(TP53和MGA)、JAK-STAT通路(STAT3和STAT5B)和表观修饰因子(MLL2、ARID1A、EP300和ASXL3)的异常。最常见的是RNA解旋酶家族的DDX3X基因突变(21/105例,20.0%),与TP53突变重叠的情况罕见。DDX3X突变肿瘤细胞呈现RNA解旋异常和细胞增殖加速。基因表达谱提示DDX3X突变和NF-kB以及MAPK途径激活关系密切。DDX3X突变的患者预后较差。
T细胞淋巴瘤(TCL)是另一亚洲常见的高侵袭性淋巴瘤类型,MYC癌蛋白在TCL发生发展中具有关键作用。然而,MYC在该疾病中的调控分子机制和靶向治疗策略亟待研究。我们的研究发现,TCL存在Ras激活、ERK和AKT磷酸化/激活,以及MYC癌蛋白的稳定性改变,形成Ras-AKT/ERK-MYC轴。对45例TCL患者血清代谢组学检测进一步显示,TCL存在胆碱代谢异常,后者主要由胆碱激酶-a(Choka)高表达而产生。T淋巴瘤细胞株中,药物性或分子阻断Choka能够显著降低Ras-GTP活性,AKT和ERK磷酸化,MYC癌蛋白表达,导致胆碱代谢的回复和肿瘤细胞凋亡/坏死。小鼠T淋巴瘤移植瘤中,Choka抑制剂CK37能够显著延缓肿瘤生长,抑制Ras-AKT/ERK-MYC轴,提高LysoPC水平,诱导原位细胞凋亡/坏死。总之,作为胆碱代谢的重要调控基因,Choka具有促癌活性并是TCL的潜在治疗靶点。
外源性凋亡异常也是导致TCL细胞对化疗药物敏感性降低的主要原因。细胞FLICE抑制蛋白(c-FLIP)是外源性凋亡途径关键的调控因子。我们运用定量PCR方法检测了61例TCL患者肿瘤c-FLIP表达水平,结果发现TCL患者高表达c-FLIP,相应低表达TRAIL/DR5,并与患者血清LDH水平和高危国际预后指数密切相关。T淋巴瘤细胞株中,分子阻断c-FLIP能够提高TRAIL/DR5表达,增强T淋巴瘤细胞凋亡以及细胞对化疗药物的敏感性。然而,组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)VPA和SAHA可通过抑制NF-kB信号通路和干扰P50与c-FLIP启动子的相互作用,下调c-FLIP表达,诱导T淋巴瘤细胞发生外源性凋亡。作为I类HDACIs,VPA和SAHA能够抑制HDAC1,导致P50失活和c-FLIP下调。小鼠T淋巴瘤移植瘤模型中,口服VPA治疗可抑制HDAC1/P50/c-FLIP轴,上调TRAIL/DR5表达,从而显著延缓肿瘤生长,诱导肿瘤细胞原位凋亡。总之,TCL中c-FLIP高表达保护肿瘤细胞不发生外源性凋亡,导致疾病进展。虽然与化疗敏感性密切相关,c-FLIP提示肿瘤细胞对HDACIs的敏感性,可作为TCL促凋亡治疗,特别是HDACIs治疗敏感性的潜在分子标志。
 
年度发表论文
1.Yan ZX, Wu LL, Xue K, Zhang QL, Guo Y, Romero M, Leboeuf C, Janin A, Chen SJ, Wang L, Zhao WL. MicroRNA187 overexpression is related to tumor progression and determines sensitivity to bortezomib in peripheral T-cell lymphoma. Leukemia 2014;28:880-887.
2. Yang F, Xiong J, Jia XE, Gu ZH, Shi JY, Zhao Y, Li JM, Chen SJ, Zhao WL. GSTT1 deletion is related to polycyclic aromatic hydrocarbons-induced DNA damage and lymphoma progression. PLoS One 2014;9:e89302.
3. Zhang L, Chen QS, Xu PP, Qian Y, Wang AH, Xiao D, Zhao Y, Sheng Y, Wen XQ, Zhao WL. Catechins induced acute promyelocytic leukemia cell apoptosis and triggered PML-RARαoncoprotein degradation. J Hematol Oncol 2014;7:75.
4. Zhou JY, Yu SJ, Wang Y, Gu X, Wu Q, Xue Y, Shan G, Zhang HP, Zhao WL, Chao Y. Serum metabolite profiling of B-cell non-Hodgkin’s lymphoma using UPLCQTOFMS and GC-TOFMS. Metabolomics 2014;10:677-687.
5. Zheng Z, Cheng S, Wu W, Wang L, Zhao Y, Shen Y, Janin A, Zhao WL. c-FLIP is involved in tumor progression of peripheral T-cell lymphoma and targeted by histone deacetylase inhibitors. J Hematol Oncol. 2014;7:88.
6. Xu P, Yu D, Wang L, Shen Y, Shen Z, Zhao W. Analysis of prognostic factors and comparison of prognostic scores in peripheral T cell lymphoma, not otherwise specified: a single-institution study of 105 Chinese patients. Ann Hematol. 2014 Epub
 
五、血友病基因治疗和白血病免疫治疗基础研究(奚晓东)
本课题组现有两个主要的研究方向:一、血栓与止血过程相关的信号转导和调控机制的研究;二、凝血因子及遗传性出血病和血栓病的研究。
2014年研究方向一的工作进展如下:明确了RGT肽通过干扰β3/c-Src的相互作用进而抑制整合素αIIbβ3外向内信号转导不依赖于其靶定细胞膜;RGT肽的结合不会影响c-Src的活性。在流体条件下,RGT肽在剪切率1500 s-1时能部分抑制血栓的形成,但在剪切率500 s-1或150 s-1时无明显抑制作用。通过模拟RGT肽与c-Src结合的空间构象找到121个具有类似RGT特征的小分子,从中筛选出84号小分子能干扰β3/c-Src的相互作用并抑制整合素αIIbβ3外向内信号转导;体内实验证明84号小分子能延长FeCl3诱导颈动脉血栓形成的时间,但并不影响小鼠尾出血时间。利用骨髓移植转基因小鼠模型,在静态和流体环境下,证实了截去了β3尾端NITY模序的小鼠血小板(β3-ΔNITY)双向信号转导基本不受影响,而截去了β3尾端TNITYRGT序列的小鼠血小板(β3-Δ754)双向信号转导均受到影响,截去β3尾端RGT序列的小鼠血小板(β3-Δ759)外向内信号转导受损而内向外信号转导不受影响。另外,利用血流剪切力模拟仪Bioflux 200实时观察了不同剪切率对血栓形成的影响。明确了随着剪切率的升高,血栓的厚度呈线性上升;而血栓的总体积和面积以及血栓形成的数量和血栓的平均体积和面积呈现先升高后减低的趋势。阐明了剪切率对血小板的沉积、血栓体积增大和血栓脱落之间的动态平衡的影响。以上结果已向本领域专业期刊投稿两篇论著,目前正在审稿过程中。
2014年度研究方向二主要对血友病A/B及遗传性凝血因子缺陷症进行了基因诊断、分子发病机制研究及抑制物产生机制研究。采用AccuCopy技术对F9基因进行了拷贝数检测,共诊断了7例大片段缺失突变血友病B患者。同时,通过引物组步移策略和基因组步移技术寻找断裂点,从而推断其重组机制,提高了血友病患者的诊断率,研究结果发表于Thromb Haemost(IF:5.570)。阐明了一个重型血友病家系中一种新的1号内含子重组机制,研究结果发表于Thromb Haemost。此外,对遗传性凝血因子X缺陷症的氨基酸缺失突变(FX-D185del)的体外蛋白功能研究表明,突变蛋白水解底物的活性以及被抗凝血酶及组织因子途径抑制物灭活的速率同时降低,从而在凝血因子X蛋白结构与功能关系的角度解释了患者轻型的临床出血表现,研究成果发表于Thromb Res(IF:2.427)。采用巢式PCR及直接测序检测异常剪切方式,结合实时荧光定量PCR及共扩增荧光PCR对患者体内残留的野生型转录产物进行定量,显示残留的野生型转录产物含量与患者临床严重程度间有较好的相关性,此方法可用以预测剪切位点突变血友病A患者临床表型,相关论文已被J Thromb Haemost接受(IF:5.550)。此外,还对血友病B患者抑制物产生机制进行了研究,发现患者凝血因子制剂及PCC治疗、F9基因无义突变与抑制物发生正相关,而CD4495102(A/T)位点T多态性则具有一定的保护效应,相关研究成果已被Haemophilia接受。
 
1.You GL, Chi K, Lu Y, Ding QL, Dai J, Xi XD, Wang H, Wang XF. Identification and characterisation of a novel aberrant pattern of intron 1 inversion with concomitant large insertion and deletion within the F8 gene. Thromb Haemost 2014; 112: 264-70.
2.Wu X, Lu Y, Ding Q, You G, Dai J, Xi X, Wang H, Wang X. Characterisation of large F9 deletions in seven unrelated patients with severe haemophilia B. Thromb Haemost 2014; 112: 459-65.
 
六、造血干细胞发育和表观遗传学(代理课题组长施静艺)
课题组通过斑马鱼发育-疾病模式生物体,结合“前向” 遗传学筛选策略,研究正常造血干细胞和白血病干细胞自我更新和多潜能维持的发育和表观遗传学机制。利用特异性标记斑马鱼造血细胞群的转基因斑马鱼系,筛查参与造血发育调控的miRNA,阐释其生理功能。
1、  调控斑马鱼造血干细胞自我更新、迁移、增殖、分化过程中的关键功能基因和分子信号路径
课题组研究发现,组蛋白去甲基化酶Jmjd3通过和C/EBPβ的相互作用控制PU.1 的表达调控髓系前体细胞的分化。PU.1的表达代表了髓系发生关键的分子生物学事件,PU.1的下调可能导致急性髓系白血病的发生。然而,在髓系命运决定过程中PU.1的转录调控还不清楚。一种含有JMJC结构域的组蛋白H3K27去甲基化酶Jmjd3,对于斑马鱼和哺乳动物髓系前体细胞的发育是至关重要的的。Jmjd3和C/EBPβ相互作用,共同占据PU.1上游一段高度保守的调控元件,通过降低其H3K27me3的水平促进染色质构象的激活。实验结果证明Jmjd3通过促进PU.1的表达在髓系前体细胞分化过程中发挥关键作用,在不同类型的AML病人骨髓的原代细胞中,过表达JMJD3之后,发现其分化明显增强。
2、  利用特异性标记斑马鱼造血细胞群的转基因斑马鱼系,筛查参与造血发育调控的miRNA,阐释其生理功能
miR-142-3p作为斑马鱼中性粒细胞发育的必要调节因子发挥作用。课题组利用锌指蛋白核酸酶技术获得了miR-142a和miR-142b的可遗传突变。在miR-142双突变的斑马鱼模型中完全性缺失miR-142-3p,后者导致斑马鱼呈现随年龄增长的慢性髓系造血衰竭。转录组分析显示缺失miR-142-3p能够异常激活干扰素信号通路来调节中性粒细胞的形成和分化。
3、            ENU突变斑马鱼家系的测序和保种工作
利用斑马鱼模式生物,通过化学诱变技术进行“前向”遗传学筛选是研究脊椎动物发育的一个有力手段。课题组尝试通过斑马鱼外显子捕获结合高通量的二代测序技术进行3例突变家系的分析,以获得致病基因信息,这些突变家系均以定向造血缺陷为特征,并伴有表型异常。综合纯合突变子代和突变家系父鱼母鱼的基因组序列等信息后,我们目前已初步确定了这3例突变家系的致病位点,进一步的功能验证分析正在进行中。此外,经过前期条件摸索,平台已成功掌握精子冻存方法,冻存的精子复苏率可维持在25%左右,现已陆续开展突变家系的保种工作。
 
年度发表论文
1.Fan HB, Liu YJ, Wang L, Du TT, Dong M, Gao L, Meng ZZ, Jin Y, Chen Y, Deng M, Yang HT, Jing Q, Gu AH, Liu TX, Zhou Y. miR-142-3p acts as an essential modulator of neutrophil development in zebrafish. Blood 2014;124:1320-30.
2.Du TT, Xu PF, Dong ZW, Fan HB, Jin Y, Dong M, Chen Y, Pan WJ, Ren RB, Liu TX, Deng M, Huang QH. Setdb2 controls convergence and extension movements during zebrafish gastrulation by transcriptional regulation of dvr1.Dev Biol 2014;392:233-44.
3. Dong ZW, Ren CG, Xia Y, Su D, Du TT, Fan HB, Yuan H, Wang L, Dong M, Li WC, Jin Y, Chen Y, Deng M, Liu TX, Gu AH, Zhou Y. Pten regulates homeostasis and inflammation-induced migration of myelocytes in zebrafish. Journal of Hematology & Oncology 2014;7:17.
 
七、肿瘤遗传及表观遗传学研究(张济)
染色体的高维结构而并非单独的DNA是细胞的“指挥中心”,正是这个指挥中心提供着多层面的指令从而决定着细胞的类型、细胞的定向及成熟分化。在过去的十数年来,本课题组主要集中在与肿瘤发生以及肿瘤治疗相关的重要问题,并通过全基因组水平的组学手段进行探讨与研究,其中包括转录组层面的基因芯片已经染色质免疫共沉淀与DNA测序相结合的ChIP-seq技术。就组学技术的应用而言,其中最具有挑战性的当属数据挖掘。在数据挖掘方面,本课题组也先后开发了一系列相关的全新方法,其中以分析基因或蛋白表达数据为主的CPP-SOM 以及分析ChIP-seq 数据为主的TSS-DM,同时也在国际上获得了一定的声誉。例如,前不久被邀请撰写的 “自主组织图应用于生物组学数据的可视、数据过滤及聚类”的章节在短短的一年期间就被下载了两千余次,而下载的国家则以美欧居先。同样,最近所开发的TSS-DM 方法也展示出了其在分析ChIP-seq数据方面的鲁棒性及其高度应用力度,从而为全面整合分析转录因子结合位点、组蛋白修饰所反映出的染色质高维结构特点提供了可能,而正是这些特点在决定着细胞的生理或病理过程。证明这一方法的范例则是最近我研究组所进行的决定维甲酸诱导APL细胞的中性粒细胞定向、成熟分化染色质特征的工作。早些时候,我组通过整体性研究融合蛋白PML/RARα在造血前体细胞中分子效应,发现PML/RARα选择性地抑制了血液特异转录因子PU.1的靶基因从而造成粒系分化受阻。然而,由于PU.1的表达及其功能在粒系中相当广泛,所以该研究未能解答为何PML/RARα所造成的粒系分化受阻是特异性的阻断在早幼粒阶段。同样,为何维甲酸所介导的分化治疗是早幼粒向中性粒细胞定向、成熟分化?就上述问题,我组针对PML/RARα、PU.1及其若干其它转录因子、辅助因子的结合位点,以及十数种组蛋白修饰,通过ChIP-seq先后在维甲酸处理前后的APL细胞中进行了全基因组水平的研究,并通过TSS-DM方法分析。结果发现了一系列反映染色质高维结构的特点,而正是这些特点在决定着维甲酸处理的APL细胞必须进行中性粒细胞的定向及成熟分化。
 
八、基因调控课题组(王侃侃)
本课题组以高通量技术平台为基础,白血病为主要研究对象,在RNA-seq数据分析、基因组DNA测序数据分析及融合蛋白调控下游靶基因等方面开展研究。
本年度取得的主要进展有以下几个方面:
1.深入研究白血病中关键融合蛋白对其靶基因的异常转录调控机制。
深入细致地研究白血病发生过程中累及的关键基因的转录调控机制对于揭示白血病发生机制非常重要,不仅能为揭示白血病累及的异常调控网络提供重要的理论基础,还能为优化临床治疗方案提供更多的潜在靶点和功能通路。
我们研究了白血病发生中累及的具有抗原呈递作用的免疫蛋白酶体亚基(PSMB8、PSMB9、PSMB10,简称PSMBs)在白血病发生的转录调控机制。通过全基因组结合位点的ChIP-seq分析、分子生物学和细胞生物学等方法,整合蛋白组、转录组多方面数据,发现PSMBs被融合蛋白PML/RARα通过协同调控机制抑制表达,从而使得APL细胞逃避T细胞的识别和攻击。ATRA处理后通过上调PMSBs表达恢复T淋巴细胞对APL细胞的识别。这一工作从融合蛋白角度揭示了白血病细胞免疫逃避的分子机制,诠释了关键因子的异常转录调控对疾病发生发展的重要作用,成果发表在2014年Oncogene杂志上。
我们还研究了细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2D(CDKN2D)的异常转录调控机制。通过ChIP、分子生物学和细胞生物学等实验,我们发现PML/RARα能够特异性抑制的CDKN2D的表达,进一步深入研究揭示CDKN2D作为细胞周期和细胞分化协同调节因子,不仅影响了造血细胞的周期调控,同时还干扰了造血细胞的正常分化。ATRA作用后,CDKN2D表达增加,不能够促进APL细胞阻滞在G0/G1期,并且还能促进细胞分化。这一工作从细胞周期调控及细胞分化共同调节因子受到抑制的角度解析了PML/RARα致白血病发生的致病机理,该成果发表在2014年Cell Death and Disease杂志上。
2.基于全基因组测序数据筛选急性髓系白血病的特征性标志物。
针对TCGA中AML不同亚型病人样本的RNA-seq数据以及本课题组AML病人样本的测序数据,我们利用生物信息学方法已经挖掘出不同亚型AML特征性的转录本,并发现新的转录本或剪切形式。其中,我们重点关注不同亚型AML特征性的非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA),尤其是长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)的挖掘,我们将利用分子生物学和细胞生物学实验进一步研究这些新发现的重要lncRNA在AML发生及治疗中的重要功能。
另一方面,我们与临床血液科室合作,研究和挖掘急性早幼粒细胞白血病(APL)伴随的与疾病发生转归密切相关的体细胞突变。虽然以ATRA+ATO±蒽环类化疗药物为基础的治疗方案在成功治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)上取得了显著疗效,但仍存在以下两个难以解决的问题:一是ATRA和ATO联合用药依然无法避免高危APL患者的早期死亡;二是部分APL患者的复发耐药现象。因此,我们将结合前期所获得病人的RNA-seq数据,利用Illumina公司新推出的HiSeqXTen测序仪对样本的DNA进行全基因组高通量测序,对不同病人基因组上基因变异等信息进行全面的检测,从而发现APL患者早期死亡和复发相关的体细胞突变。。
 
年度发表论文
1.Yang X, Wang P, Liu J, Zhang H, Xi W, Jia X and Wang K. Coordinated regulation of the immunoproteasome subunits by PML/RARa and PU.1 in acute promyelocytic leukemia. Oncogene 2014;33(21):2700-8.
2. Wang Y, Jin W, Jia X, Luo R, Tan Y, Zhu X, Yang X, and Wang X, Wang K. Transcriptional repression of CDKN2D by PML/RARa contributes to the altered proliferation and differentiation block of acute promyelocytic leukemia cells. Cell Death and Disease 2014; 5, e1431.
 
九、感染性疾病和血液病相关基因的结构生物学研究(蒙国宇)
1.血液病结构生物学研究
急性早幼粒细胞性白血病(APL)占急性髓细胞性白血病的10%,肿瘤细胞分化受阻于早幼粒阶段,95%的病人具有特征性t(15;17)(q22;q21)异位,导致位于15号染色体的PML基因及位于17号染色体的RARα基因的融合,形成PML-RARα融合蛋白。PML位于基因组15q22,包含9个外显子,外显子不同的拼接,形成至少7个isoforms。 在结构上,PML的N末端为脯氨酸富集区,其后为RBCC结构域,包括Ring,B Box-1,B Box-2锌指结构域和Coiled-Coil结构域。同时,RAR作为维甲酸受体通过与另一类维甲酸受体RXRs (retinoid X receptors) 形成异源二聚体,经维甲酸活化后结合于维甲酸反应元件(RARE),调控基因的转录。所有类型的PML-RARα融合蛋白均含有PML的RBCC锌指结构域,进一步提示PML RBCC结构域在融合蛋白诱发白血病中的重要作用。
最近上海血液学研究所研究人员通过对重组的PML N端锌指结构与As2O3体外相互作用的研究,发现
(1)PML N端锌指结构可以与As相结合,每个锌指结构,包括Ring,B Box1,B Box2,可以结合2个As。
(2)以PML Ring为模型,研究了PML Ring与As的配位,发现As结合到PML Ring上保守的半胱氨酸残基上。
(3)PML Ring与As的结合诱导了不同于与Zn配位的构象变化。
因上可见,上海血液学研究所在APL白血病的研究中进行了大量基因和功能的研究,为结构生物学研究奠定了雄厚的基础。申请人计划以结构生物学,特别是以晶体衍射学为主要手段,并结合现有分子生物学、基因芯片、蛋白质谱和动物模型等技术, 进一步更好地阐述APL白血病发病的结构生物学基础,通过对重要致病(靶点)蛋白PML-RARa结构的分析,设计和改善现有的小分子药物,寻找新的治疗药物和方法。
到目前为止,我们已通过X-射线结晶学确定PML-RING结构域的晶体结构。高分辨率的晶体结构揭示了一种通过新的PML蛋白的组装机制。基于结构的定点突变、超速离心法和电镜等实验表明,PML的ring结构域的寡聚是PML核小体的形成至关重要环节(文章在撰稿中)。此外,据报道,PML-RARa融合蛋白基因在急性早幼粒细胞白血病的主要致病蛋白。根据我们的最新结构的提示,我们将利用动物实验探讨PML-RARa聚合与白血病发病的关系。目前这部分工作正在开展中。
2.感染性疾病结构生物学研究
课题组将始终围绕着以下几个科学问题展开研究:1)病原菌如何产生毒素蛋白;2)病原菌如何利用这些蛋白进行自我保护;3)在感染过程,病原菌如何利用这些毒素蛋白与宿主结合;4)在感染过程,病原菌如何利用这些毒素蛋白形成生物膜(biofilm),持续感染。研究涉及:革兰氏阴性菌协助外膜蛋白的插膜系统,即β- barrel assembly complex。该跨膜蛋白聚合物系统,是外膜合成的重要组成部分,抑制该系统将能有效抑制革兰氏阴性菌的生长。因此,对该聚合物的理解,将有助于研发针对革兰氏阴性菌病原体的高效抗生素。另一方面,该跨膜蛋白聚合物在生物界高度保守,在真核细胞的线粒体内也有发现类似的协助外膜蛋白插膜的系统,因此,准确地理解革兰氏阴性菌中插膜系统的工作机理,将有助于我们对线粒体外膜插膜系统的进一步理解,从而最终将有可能阐述线粒体在人类衰老过程中所起到的作用以及与线粒体相关的疾病的发病机理。世界上对该复合物的研究,仍处于起步阶段。该复合物除了中心的插膜蛋白,还有几个周边子蛋白。 在流感嗜血杆菌中,BAM 的结构生物学研究目前还没有相关报道,到目前为止,本课题组成功对BAM中的组分H.influenzae BamD,BamC等进行了表达、纯化并成功对H.influenzae BamD以及BamCD进行了结晶,通过X射线衍射获得了BamD 最高到4Å分辨率,以及复合物BamCD最高到3.8Å分辨率的衍射数据。
 
十、肿瘤靶向治疗研究(任瑞宝)
本年度主要研究方向仍集中在RAS相关肿瘤靶点鉴定及化学干预,主要研究进展为:
1.棕榈酰转移酶DHHC9NRAS诱导的白血病发病中起重要作用
RAS是包括白血病在内的许多人类恶性肿瘤中最为常见的原癌基因之一,而目前依然缺乏针对RAS相关肿瘤的靶向治疗。RAS蛋白质的信号传导功能的发挥依赖于其脂质修饰后的细胞质膜定位。蛋白质棕榈酰化是一类重要的翻译后脂质修饰,HRAS,NRAS和KRAS4A的棕榈酰化修饰调控它们与质膜结合以及细胞内的运输。这一过程由棕榈酰化转移酶(Palmitoyl-acyltransferases, PATs)DHHC蛋白质家族成员负责介导。但PATs的正常生理功能及其在肿瘤发生发展中的作用尚不清楚。
  我们前期研究首次证明了棕榈酰化修饰在NRAS引起的白血病过程中是必需的,提示靶向PAT有可能成为全新的治疗RAS相关肿瘤的治疗方案。而DHHC9是已知24种哺乳动物PAT中,具有在体外催化HRAS和NRAS棕榈酰化的PAT。这里,我们利用Zdhhc9基因敲除小鼠模型研究其在正常造血中的功能及在NRAS恶性转化过程中所起的作用。实验结果显示,DHHC9缺失型小鼠(Zdhhc9KO)外周血及骨髓各系细胞比例与野生型小鼠(Zdhhc9WT)相比无明显差异,造血干、祖细胞比例正常,干细胞移植的早期归巢能力无异常。而当Zdhhc9WT和Zdhhc9KO小鼠骨髓细胞表达突变型NRAS(NRASG12D)后,均导致白血病发生,但其疾病潜伏期及生存时间在DHHC9缺失后有显著延长。这一研究表明棕榈酰转移酶DHHC9单独缺失不影响骨髓正常造血,但可以影响NRASG12D诱导的白血病发生和发展过程,显示了DHHC9具有成为NRAS相关肿瘤治疗靶点的潜在可能。同时也提示哺乳动物体内可能存在多个催化NRAS棕榈酰化的PAT,揭示了蛋白质棕榈酰化修饰的复杂性。该工作已被2014年ASH会议接受为墙报,并获ASH摘要成就奖及中美血液与肿瘤学会青年科学家奖。
2.内源性大麻素/内辣椒素NADA抑制NRASKRAS4A的细胞膜定位及肿瘤转化活性
    我们采用了一种化学生物学的方法来探索针对RAS相关肿瘤的治疗新策略。因为RAS蛋白的生物学活性依赖翻译后的脂修饰,而且RAS可以调控肿瘤细胞中的脂质代谢,我们应用先前建立的RAS靶向细胞毒性的药物筛选方法,筛选了一个生物活性脂类化合物库。通过筛选,我们发现内源性大麻素/内源性辣椒素N-arachidonoyl dopamine (NADA)可以有效杀死RAS转化的细胞。在后续生物活性-结构分析中,我们进一步证明NADA的抗RAS活性是结构特异性的,并且与它本身的激活大麻素受体和辣椒素受体的生理活性无关。进一步的研究发现,相比与KRAS4B转化的细胞,NADA对NRAS和KRASA转化的细胞显示出更加有效的杀伤作用。在后续RAS通路分析中也显示一致的结果,NADA能更加明显地抑制NRAS转化细胞中ERK的磷酸化水平。有意思的是,NADA几乎可以阻断NRAS和KRAS4A的细胞膜定位,而对KRAS4B的细胞膜定位没有显著影响。然而通过对NRAS棕榈酰化水平的检测,并没有发现NADA对NRAS的棕榈酰化水平有显著影响。这提示我们NADA特异性抑制NRAS和KRAS4A的细胞膜定位是通过一种新的机制。由于NRAS突变在血液系统恶性肿瘤及一些实体瘤如黑色素瘤和结直肠癌中都很常见,KRAS4A在致癌物质诱发的肺癌形成中也起关键作用,所以这一新发现将对多种人类肿瘤的治疗策略研发提供思路。该工作已被2014年ASH会议接受为口头报告,并获ASH摘要成就奖及中美血液与肿瘤学会青年科学家奖。
 
年度发表论文:
Wang Y, Xiao M, Chen X, Chen L, Wang P, Yang H, Ma S, Zhang J, Jiao B, Ren R, Ye D, Guan K, Xiong Y. WT1 recruits TET2 to regulate its target gene expression and suppress leukemia cell proliferation. Molecular Cell. Accepted.
 
十一、白血病表观基因组学(刘晗)
本课题组长期从事MLL白血病的生物学功能和临床转化研究。2014年度本课题组在MLL白血病的临床转化研究方面取得了重要进展。我们发现了蛋白酶体抑制剂能特异地杀死表现为pro-B ALL的MLL白血病细胞,并成功地在临床上加以运用。MLL融合蛋白的功能是剂量依赖的,本身具有肿瘤抑制活性,较低水平表达可以导致恶性白血病的发生,过高水平表达则会损伤细胞。蛋白酶体抑制剂可以促进MLL融合蛋白水平升高,使得其肿瘤抑制活性得以表现,从而特异地杀死MLL白血病细胞,达到治疗目的。有趣的是,只有表现为pro-B ALL的MLL白血病细胞对蛋白酶体抑制剂敏感,而其它pro-B ALL或者AML白血病细胞则对蛋白酶体抑制剂不敏感。我们研究了其中的分子机制,发现只有在表现为pro-B ALL的MLL白血病细胞中,MLL融合蛋白可以通过B细胞特异转录因子PAX5募集转录延伸因子pTEFb,促进细胞周期抑制因子p27的表达,从而引起细胞周期阻滞。AML白血病细胞因为缺乏PAX5,而非MLL白血病的其它pro-B ALL细胞因为没有MLL融合蛋白,都不能募集pTEFb,因此都不能诱导p27的表达。另一方面,在pro-B MLL白血病细胞中,蛋白酶体抑制剂可以通过上调Caspase-8的表达,活化tBID来促进细胞凋亡的发生。我们进一步用动物模型证实了蛋白酶体抑制剂能显著延缓MLL白血病模型的进展。根据这些临床前研究的发现,我们收集了5例MLL白血病病人进行了临床研究。与预期相符,只有表现为pro-B ALL的MLL白血病病人对蛋白酶体抑制剂治疗有反应,并且其中一例病人更是获得了长达一年多的完全缓解。值得注意的是,这些病人都是事先化疗失败后才加入到我们的临床研究中的。这项成果不仅为MLL白血病这一难治疾病提供了新的有效治疗方案,而且证明了通过调控癌基因本身具有的肿瘤抑制活性来治疗肿瘤的可行性,为其它肿瘤的治疗提供了新的思路。我们这项工作于2014年发表在Cancer Cell杂志上(Liu et. al. Cancer Cell 2014),同期Cancer Cell杂志为该论文配了专评,Cancer Discovery杂志也对这项成果进行了推荐。
 
年度发表论文:
Liu H, Westergard TD, Cashen A, Piwnica-Worms DR, Kunkle L, Vij R, Pham CG, DiPersio J, Cheng EH, Hsieh JJ. Proteasome Inhibitors Evoke Latent Tumor Suppression Programs in Pro-B MLL Leukemias Through MLL-AF4. Cancer Cell 2014; 25:530-42.
 
十二、以iPS细胞来源的HSC进行血小板特异的血友病A基因治疗(章国卫)
2014年度,课题组在上一年的基础上在血友病的基因治疗方面开展了深入的研究工作:
1. 建立了血小板特异的血友病A基因治疗技术
    我们在血友病A小鼠上进行了血小板介导的基因治疗研究。我们制备了αIIb启动子控制的人F8 cDNA的慢病毒载体2bF8-LV;分离了血友病A供体小鼠HSC并以2bF8-LV进行2bF8基因的转导,经体外短暂培养后移植进入经致死剂量x射线处理的血友病A受体小鼠中。移植后4周PCR法检测所有13只受体小鼠中2bF8基因阳性,血小板F8:C平均为0.83mU/108 plt,血小板的FACS分析显示超过80%的血小板表达F8,表明我们成功地建立了高效的血小板特异的血友病A基因治疗方法。现在我们正在进行经密码子优化的F8基因治疗试验,以进一步提高血小板F8的表达水平和治疗效果。
2. 正在进行基于iPSC的血友病A基因治疗研究
    我们将小鼠尾尖成纤维细胞进行重编程诱导获得了2株血友病A小鼠iPSC(HA-iPSC)和一株野生型小鼠iPSC,RT-PCR和免疫荧光检测显示3株细胞中Nanog、Oct4、Sox2、SSEA-1等iPSC标志基因表达阳性,细胞注射入裸鼠后都可在裸鼠中形成畸胎瘤。我们以2bF8-LV感染了HA-iPSC并进行筛选,获得了成功转导的2bF8基因的HA-iPSC(HA-iPSC/2bF8)。
    为将iPSC诱导成为HSPC,我们尝试了多种方法,包括OP9细胞共培养法、hHoxB4逆病毒感染法和体内畸胎瘤形成诱导法等。在OP9细胞共培养法中,我们通过悬滴法产生拟胚体(EB)并进一步在OP9细胞层上进行定向分化,我们观察到部分细胞具有HSPC标志物c-kit和Sca-1阳性。我们也构建了hHoxB4逆病毒载体,并以此感染EB细胞后再进行OP9细胞的共培养分化,可观察到少数CD48-CD150+细胞,说明细胞向HSPC分化。我们也尝试了体内分化法,在裸鼠内共同注射HA-iPSC/2bF8和OP9细胞使形成畸胎瘤。我们从畸胎瘤中成功地分离了由HA-iPSC/2bF8分化产生iHSPC,将iHSPC移植入辐照处理的血友病A小鼠,在受体小鼠血小板中成功地检测到了FVIII的活性。说明HA-iPSC/2bF8可成功地分化成HSPC并具备继续分化产生血小板地能力。
3. 将基因组编辑技术应用于血友病的基因治疗
    治疗基因的定点插入在基因治疗中具有更高的安全性。我们在开展iPSC用于血友病A基因治疗的同时也开展了以ZFN和TALEN进行基因定点插入的研究工作。我们选择了小鼠常用的Rosa26位点作为基因的定点插入位点,现已完成了同源质粒的构建、ZFN的整合效率分析和TALEN质粒的设计和构建。接下去将进行HA-iPSC的基因修饰工作,将2bF8基因定点整合入Rosa26位点。
4. FXa进行血友病的基因治疗研究
    为进一步探索血友病A基因治疗的新方法,我们也正在探索将FXa用于血友病基因治疗的可行性。FX是在凝血反应中被FVIII和FIXa复合物激活并最终激活凝血酶原的重要凝血因子,足够的FXa可在不需要FVIII或FIXa的情况下发挥促凝血作用。我们已克隆了人FX,经定点突变在重链和轻链间引入了PACE/furin酶切位点Arg-Lys-Arg (RKR)使其在表达后产生FXa。体外表达证明可产生有活性的FXa,在HA小鼠上经高压注射证明FXa可促进凝血,缓解小鼠出血症状,通过慢病毒介导将2bFXa转入小鼠HSC中并移植进入血友病A受体小鼠中,证明FXa可在小鼠血小板中表达并发挥促凝血作用,这为基于血小板的血友病基因治疗提供了新的思路。
 
十三、造血干细胞发育和重编程的研究(孙晓建,黄秋花)
本课题组主要的研究方向是体外诱导多能干细胞或其他成体细胞生成造血干细胞。目前已建立了一系列重编程、转分化和去分化等造血重建相关的核心技术体系;另在原有工作基础上,研究了组蛋白 H3K36特异甲基转移酶SETD2在小鼠胚胎多能干细胞发育中的作用,发现其主要调控小鼠原始内胚层分化,有助于我们了解多能干细胞的分化机制。
1. 基于体细胞重编程和转分化技术获得病人特异的造血干细胞的研究
本项工作的总体目标是基于细胞重编程原理,发展体外诱导和扩增病人特异的造血干细胞的技术,从而得到安全有效且不会发生免疫排斥的造血干细胞,并阐明其关键分子机制。首先,我们建立了一系列关键技术体系,如小鼠和人多能干细胞的培养及诱导分化体系,基于逆转录病毒载体及附加体质粒(episomal plasmid)的iPSC诱导技术,以及小鼠造血细胞体内外功能鉴定的技术体系。初步通过拟胚体自发诱导分化/单层培养结合OP9基质细胞共培养的方案对小鼠多能干细胞进行了诱导分化条件的探索。此外,根据造血系统转录调控谱图我们已经克隆了一系列可能在造血转分化过程中起关键作用的调控因子,并着重选择了项目组在国际上具有原创优势的与HSC调控密切相关的几个调控因子。同时,我们正在利用生物信息学方法大规模分析GEO数据库中造血细胞的表达谱芯片数据,寻找HSC中特异富集的基因。此外,我们设计并构建了包含DNA条形码的逆转录病毒载体系统,结合DNA条形码和高通量测序的方法,可以对潜在的调控因子进行更为广泛的筛选,以得到有效的造血转分化关键因子。我们从美国 Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard University和南京模式动物中心分别引进了SCL-tTA和tetO-H2B-GFP小鼠,已通过繁殖交配及基因型鉴定得到SCL-tTA/tetO-H2B-GFP小鼠,并分离制备了此基因型小鼠E13.5的成纤维细胞,将利用其具有的能在HSC中特异启动的荧光报告基因甄别造血转分化关键基因。
2. Setd2/ Hypb 通过调控Fgfr3的转录起始影响小鼠胚胎干细胞的内胚层分化
SETD2/HYPB已被熟知是组蛋白 H3K36特异甲基转移酶,然而其在生理过程如发育和细胞功能中的作用尚不清楚。在此研究中,我们发现 Setd2 主要调控小鼠原始内胚层分化。Setd2敲除小鼠ESCs中Erk活性降低,此表型与内胚层相关基因的表达下调相关,特异性激活Erk通路可以挽救内胚层相关基因的表达水平,提示Setd2与Erk通路的调控相关。进一步的研究发现,Setd2 能催化Fgfr3(Erk信号通路上游受体)远端启动子区域的组蛋白H3K36me3修饰,通过调控其转录起始参与Erk 信号通路,从而调节小鼠胚胎干细胞原始内胚层发育。这部分工作已发表在Cell Reports (2014,Sep 25).
 
1.Zhang YL, Xie SG, Zhou Y, Xie YY, Liu P, Sun MM, Xiao HS, Jin Y, Sun XJ, Chen Z, Huang QH, Chen SJ. H3K36 histone methyltransferase Setd2 is required for murine embryonic stem cell differentiation toward endoderm. Cell Rep 2014;8:1989-2002.
2. Du TT, Xu PF, Dong ZW, Fan HB, Jin Y, Dong M, Chen Y, Pan WJ, Ren RB, Liu TX, Deng M, Huang QH. Setdb2 controls convergence and extension movements during zebrafish gastrulation by transcriptional regulation of dvr1.Dev Biol 2014;392:233-44.