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血研所2013年度各课题组进展情况
发布日期:2013-11-20 浏览次数:383

    本项目组在原有工作的基础上建立了DNMT3A R882突变的疾病模型,并研究了整体动物水平基因表达谱和甲基化修饰谱的改变;同时研究了急性髓细胞白血病代谢谱特征,发现小分子物质2-羟基戊二酸(2-HG)是一独立的预后因素;此外继完成日本血吸虫基因组计划后,本课题组与国家人类基因组学南方中心合作又参与解析了一种称为细粒棘球绦虫病(即包虫病)的重要寄生虫病原体的基因组和转录组,将有力促进包虫病的诊断、治疗和预防研究。
(一)DNMT3A R882突变通过影响造血细胞的基因转录/DNA甲基化过程和细胞周期调控过程来诱发慢性粒单细胞白血病样的疾病表型
表观遗传学是已知的维持造血系统稳态的一个重要调控网络,DNA甲基转移酶3A蛋白(DNMT3A)作为一种重要的表观修饰相关蛋白,其编码基因近来被报道在急性白血病患者中有~20%的突变率,尤其是R882位点的突变频率最高。为深入探索DNMT3A突变对造血和致白血病上的作用,我们将DNMT3A-R882H突变体转导入小鼠造血干祖细胞或者细胞系,在体内和体外均发现突变对细胞的分化和增殖产生影响。DNMT3A-R882H突变小鼠六个月时主要引起骨髓内LSK(Lin-Sca-1+C-kit+)细胞群以及长程造血干细胞群的比例增加,一年时可引起单核细胞和巨核细胞的异常增多,诱发类似人类慢性粒单细胞白血病样的疾病表型。此外,通过表达谱芯片的检测,我们发现移植后六个月的小鼠突变细胞中与造血干细胞活性相关的基因高表达,在移植后一年的小鼠突变细胞中部分与造血相关的基因表达异常,而通过对全基因组胞嘧啶甲基化水平的检测,我们进一步发现这些异常表达的基因在Gene body区出现了甲基化的修饰改变。我们还通过蛋白质质谱检测和体外RNAi方法发现DNMT3A突变体与CDK1蛋白结合能力增强,并会影响CDK1的表达,推测可能是通过调变细胞周期来促进细胞增殖效应。相关研究结果《Proc Natl Acad Sci USA》修回。
(二)2-羟基戊二酸水平在初发急性髓细胞白血病中的预后意义研究
先前的研究证实,肿瘤细胞包括急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)细胞发生异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1, IDH1)和/或异柠檬酸脱氢酶2(isocitrate dehydrogenase 2, IDH2)突变,可产生一个被称为癌代谢物的小分子物质2-羟基戊二酸(2-hydroxyglutarate, 2-HG)。但是,2-HG水平对血液恶性肿瘤尤其是AML是否具有临床预后意义尚不清楚。本研究中,我们利用气相色谱-飞行时间质谱联用仪分析了各种血液恶性肿瘤患者以及健康志愿者血清中的2-HG水平,发现该代谢物只在AML中有显著升高。根据健康对照数据得到的2-HG临界值(2.01,由4.03μg/ml经过log2转化而来),我们发现来自多个临床中心的367例AML患者中有62例(17%)具有高水平的2-HG。在高2-HG组AML患者中,根据该组2-HG值的中位数,将这组患者细分为非常高2-HG组和中等高2-HG组。在非常高2-HG组中,87%的患者具有IDH1/2的突变;但是在中等高2-HG组中,只有29%的患者有IDH1/2突变,这样的结果提示AML中可能还存在其他的、可导致2-HG升高的遗传学或者生物化学异常事件。在234例染色体核型正常的AML患者中,高水平2-HG与差的总生存以及差的无事件生存相关联。单因素和多因素分析显示,高水平的2-HG是独立于其他临床和分子生物学指标的预后因子。此外,与正常2-HG的AML白血病细胞相比较,高2-HG的AML白血病细胞表现出不同的基因表达谱和DNA甲基化谱,此外,我们还发现,在高2-HG组患者中谷氨酰胺分解代谢通路中的代谢物,支持了2-HG生成的代谢谱特征。这样的结果提示2-HG可能参与了白血病的发生。相关研究成果发表于Proc Natl Acad Sci USA》。
棘球蚴病,即包虫病是由棘球绦虫所引起的人类寄生虫病,它不仅严重危害人类健康,而且对畜牧业生产造成重大损失。包虫病在全世界120多个国家流行,我国西北地区是重灾区之一。为了提高包虫病的诊断、治疗和控制水平,我们完成了细粒棘球绦虫基因组测序和基因功能解析。细粒棘球绦虫基因组由1.5亿个碱基组成,含有11325个蛋白编码基因。通过比较基因组学分析,我们发现了一系列的与其生长、发育和繁殖相关的重要功能基因,其中包括对宿主免疫有调控作用的EgAgB基因家族。在细粒棘球绦虫基因组中,我们发现了胆酸盐的核受体(FXR和VDR),而无胆酸盐膜受体(TGRF5)。其提示细粒棘球绦虫原头蚴只有在终宿主(狗)肠道内高浓度胆酸盐的条件下才能发育成为成虫,这一结果首次揭示了棘球绦虫独特的双向发育的调控机制。于此同时,我们发现了与吡喹酮作用相关的钙离子通道基因(EgCavb1)在功能区域的关键位点序列与血吸虫相同,而与它们宿主基因序列不同。这一结果提示这些关键位点序列的差异可能与吡喹酮作用效率密切相关。细粒棘球绦虫基因组的解析揭示了细粒棘球绦虫与宿主的相互作用,包括营养摄取、生长发育、繁殖、免疫逃避等,将为包虫病的诊断试剂、治疗药物和预防疫苗的研究和开发提供了一个丰富和系统的信息资源。相关的研究成果于今年9月以论文形式发表在《Nature Genetics》上。
年度发表论文
2.    Xu J, Wang YY, Dai YJ, Zhang W, Zhang WN, Xiong SM, Gu ZH, Wang KK, Zeng R, Chen Z, Chen SJ. DNMT3A Arg882 mutation drives chronic myelomonocytic leukemia through disturbing gene expression/DNA methylation in hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci USA 2014;7;2620-2625.
3.    Chen SJ, Chen Z. Targeting Agents Alone Cure Acute Promyelocytic Leukemia. The New England Journal of Medicine 2013;369:186-187.
4.    Chen SJ, Chen Z. A panoramic view of acute myeloid leukemia. Nature Genetics 2013;6 :586-587.
5.    Zheng HJ, Zhang WB, Zhang L, Zhang ZZ, Li J, Lu G, Zhu YQ, Wang YZ, Huang Y, Liu J, Kang H, Chen J, Wang LJ, Chen AJ, Yu ST, Gao ZC, Jin L, Gu WY, Wang ZQ, Zhao L, Shi BX, Wen H, Lin RY, Malcolm K Jones, Brona Brejova, Tomas Vinar, Zhao GP, Donald P McManus, Chen Z, Zhou Y, Wang SY. The genome of the hydatid tapeworm Echinococcus granulosus. Nature Genetics 2013; 45:1168-1177.
 
年度专利情况:
授权国内发明专利1项:《中药复方制剂砷靛参及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用》
专利号:ZL200910051409.5
申请国内发明专利1项:《二羟基戊二酸或其检测试剂的用途》
专利号:201310455927.X
 
本课题组对多种急性白血病包括急性早幼粒细胞白血病t(11;17)变异型染色体易位和急性T/髓细胞性白血病t(3;11)(q29q13;p15)进行分子发病和治疗学研究,并解释了后者染色体易位受累基因IQCG激活下游钙离子信号通道可能的分子机制。同时,之前实验研究发现的治疗白血病的有效药物毛萼乙素还可通过抑制致病性Th1和Th17淋巴细胞亚群缓解小鼠自身免疫病多发性硬化症。此外还成功组织了急性早幼粒和髓系白血病治疗的两项全国性随机多中心临床研究,成果分别发表于《Journal Clinical Oncology》和《Lancet Oncology》。还受《The New England Journal of Medicine》和《Nature Genetics》杂志邀请撰写了“Editorial” 和“News and Views”。
(一)8-CPT-cAMP与全反式维甲酸合用靶向治疗t(11;17)急性早幼粒细胞白血病的机制研究
约1~2%的急性早幼粒细胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia,APL)患者携带t(11;17) 变异型染色体易位形成PLZF-RARα和RARα-PLZF融合基因,并对全反式维甲酸(ATRA)诱导分化治疗具有耐药性,因此预后较差,其相关治疗方案亟待完善。为研究t(11;17) APL这一耐药机制并优化治疗方案,我们建立了一种同时带有PLZF-RARα和RARα-PLZF融合基因的可移植转基因小鼠白血病模型,使之较忠实地模拟人类疾病。小鼠移植实验证实t(11;17) APL的白血病起始细胞(Leukemia-initiating cell, LIC)富集于髓系定向祖细胞群体中(Mac-1+/Gr-1+/c-Kit+)。通过筛选多种可能与ATRA产生协同作用的药物,我们发现8-CPT-cAMP通过激活PKA通路,引起PLZF-RARα蛋白质Ser765位点磷酸化,促使SMRT/NCoR1复合体与PLZF-RARα蛋白质的相互作用被加速解离,继而改变所在的染色质构象并重新激活在病理状态下被抑制的维甲酸通路。与此同时,8-CPT-cAMP还促进了ATRA引起的PLZF-RARα蛋白的降解。小鼠体内药物治疗表明,8-CPT-cAMP可通过对LIC的有效清除而显著增强ATRA治疗效果。这些结果表明,8-CPT-cAMP联合ATRA可通过增强对白血病细胞的诱导分化和促进癌蛋白的降解发挥治疗作用,有望改善t(11;17) APL患者的疗效与预后,成为一个有潜力的治疗新策略。相关研究结果发表于Proc Natl Acad Sci USA (2013) vol. 110 (9) pp. 3495-500。
(二)新的白血病受累基因IQCG在造血发育中的功能研究
实验室前期工作在一例伴t(3;11)(q29q13;p15)易位的急性T/髓细胞性白血病患者中定位克隆了一个新的融合基因 NUP98‐IQCG。其中,IQCG是被首次发现与NUP98融合,参与人类造血系统疾病的发生,它的功能尚未被人们揭示。我们的工作利用斑马鱼模式动物研究了IQCG在造血发育中的作用。
我们发现:在iqcg敲低的斑马鱼胚胎中,造血干细胞以及下游分化的各系血细胞数量均下降。深入研究发现,这个表型是由于造血干细胞增殖减少造成的。在研究IQCG的生化功能的时候,我们发现IQCG能与钙调素(CaM)发生直接相互作用。iqcg敲低的斑马鱼胚胎中,钙调素依赖的激酶IV(CaMKIV)活性下降,重新激活CaMKIV可以挽救iqcg缺失的造血表型。我们将斑马鱼camkIV敲低,能得到与iqcg敲低一致的表型。综合以上可以得知,CaMKIV可能是受IQCG调控的下游信号分子。
为了深入研究IQCG如何参与钙信号通路,我们用表面等离子共振实验检测了IQCG在无钙离子和有钙离子存在两种条件下与钙调素的作用强度,并解析了这两种情况下IQCG的IQ基序与钙调素的两种复合物的晶体结构。我们发现:无钙离子条件下,IQCG与钙调素有很强的结合力(KD=5.07nM);而在钙离子存在的条件下,两者的结合力变得很弱(KD=180nM)。并且,无钙复合物向有钙复合物转变的时候会发生先解离后结合。另外,我们还发现与钙-钙调素结合力更高的CaMKIV(KD=9nM)可以在HSP70的介导下与IQCG共定位。因此,原钙调素与IQCG的复合物在结合了钙离子并发生解离之后,更倾向于形成钙-钙调素与CaMKIV的复合物,而不是钙-钙调素与IQCG的复合物。在无钙离子条件下,IQCG可以储存钙调素蛋白;而在细胞被激活以后,IQCG则将钙-钙调素递交给与钙-钙调素结合力更强的CaMKIV,通过这样的模式来调控钙信号,进而影响了斑马鱼造血发育。
综上所述,我们利用发育生物学的研究方法阐明了IQCG在斑马鱼定向造血发育中的重要功能和可能的下游分子,并结合分子生物学、生物化学和结构生物学的方法解释了IQCG激活下游信号的可能的分子机制。《Nature Communication》修回中。
(三)毛萼乙素通过抑制致病性Th1Th17淋巴细胞亚群缓解小鼠自身免疫病
毛萼乙素(Eriocalyxin B, EriB)是一种分离自毛萼香茶菜属(Isodon eriocalyx)植物的二萜类化合物。本研究利用MS的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠进一步探索了毛萼乙素潜在的抗炎性质。研究结果显示,毛萼乙素给药可有效缓解小鼠EAE病情,减轻其脊髓病灶部位的炎性浸润和脱髓鞘病变。小鼠淋巴细胞在用自身抗原髓少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)刺激培养,经毛萼乙素处理后,这群细胞失去过继移植的致病能力。机制研究显示,毛萼乙素通过阻滞异常活化的JAK/STAT,NF-κB信号通路以及上调ROS水平,选择性地抑制了EAE小鼠体内致病性Th1和Th17细胞的分化和增殖,从而起到缓解疾病的作用。这些研究结果提示,毛萼乙素在自身免疫等炎性疾病中可能也具有良好的应用前景。研究成果发表于Proc Natl Acad Sci USA 2013 Jan. 25;110(6):1158-63。
1.    Lu Y, Chen B, Song JH, Zhen T, Wang BY, Li X, Liu P, Yang X, Zhang QL, Xi XD, Chen SD, Zuo JP, Chen Z, Chen SJ. Eriocalyxin B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis by suppressing Th1 and Th17 cells. Proc Natl Acad Sci USA 2013; 110: 2258-2263
5.    Chen SJ, Chen Z. Targeting Agents Alone Cure Acute Promyelocytic Leukemia. The New England Journal of Medicine 2013;369:186-187.
6.    Chen SJ, Chen Z. A panoramic view of acute myeloid leukemia. Nature Genetics 2013;6 :586-587.
 
年度专利情况:
授权国内发明专利1项: 《一种治疗非小细胞肺癌的组合药物》
专利号201210158747.0
 
三、造血细胞信号转导和白血病干细胞(诸江)
在2013 年度,研究小组集中精力做二方面的工作。其一,我们对下述三方面的工作进行了完善。它们分别为:1)急性早幼粒白血病(APL)白血病起始细胞(LICs)的分化路径的复杂性及调控机制;2)人成骨肉瘤干细胞的分离鉴定及靶向诱导分化治疗;及3)维甲酸诱导基因I(Rig-I)调控白血病细胞AKT活化及增殖的相关分子机制的解析。在第一项工作中,过去一年的工作进一步揭示白血病起始细胞分化过程的多阶段性及分化方向的复杂性。我们的结果提示APL特异致癌蛋白PML/RARa可能靶向转化一个GMP阶段的祖细胞,故APL的LICs不但具有粒系分化也有单核系分化的潜能,并且其主要分化趋势实际上已偏向单核系。维甲酸可有效地促进LICs的早期分化及粒系分化,但不能解除主要的单核系分化受阻。该结果为维甲酸抵抗现象提供了新的细胞学机制解释。在第二项工作中,我们在机制研究方面进一步完善了有关 mTOR对人高危成骨肉瘤干细胞干性的维持效应的解析,特别是在肉瘤干细胞终末分化中raptor对细胞周期调控蛋白p21的抑制作用,并在体内模型进行了验证。在第三项工作中,我们阐明了一个以往未认知的、Rig-I的病毒RNA识别非依赖的机制。我们发现未识别病毒RNA的Rig-I可与Src结合并调节其下游底物如AKT的活化,从而发挥一个重要的细胞增殖调控作用。重要是,实际上病毒RNA与Rig-I结合可抑制Rig-I对Src的调节,提示Rig-I对Src的调节效应可能代表了非感染状态的Rig-I的一基本特性。同时,我们在一些新的课题方向取得了进展,特别是有关Rig-I对HSC自我更新和分化的调节作用及机制研究。我们发现Rig-I在HSC中有较高表达,Rig-I缺失可破坏HSC静息状态的维持及其造血重建能力。机制分析提示Rig-I参与HSC DNA修复及反应 的调控机制。另外,在有关白血病造血动力学研究方面,我们发现,白血病细胞的炎症行为可能在导致“正常造血抑制”的病理过程中发挥着关键作用,为干预白血病临床疾病进程提供了新的思路。在人弥漫大B淋巴瘤相关蛋白Blimp-1降解的分子机制方面也获得一些有价值的结果。
年度发表论文:
Li XY, Jiang LJ, Chen L, Ding ML, Guo HZ, Zhang W, Zhang HX, Ma XD, Liu XD, Xi XD, Chen SJ, Chen Z, Zhu J. RIG-I modulates Src-mediated AKT activation to restrain leukemic stemness. Molecular Cell 2013;13-12-7 accepted.
 
四、实验血液学研究(赵维莅)
2013年课题组主要致力于MYC相关恶性淋巴细胞疾病进展标志物和靶向治疗的研究。
Burkitt淋巴瘤/白血病是侵袭性B细胞恶性淋巴细胞疾病的重要亚型,具有特征性癌蛋白MYC的高表达。生物靶向治疗有助于改善患者的临床预后,是该疾病研究的热点。我们应用组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂丙戊酸(VPA)联合哺乳动物雷帕霉素(mTOR)抑制剂他西罗莫司处理Burkitt淋巴瘤/白血病细胞株、患者原代细胞和治疗鼠移植瘤模型,探索出联合靶向MYC癌蛋白的药物组合。联合VPA和他西罗莫司能够协同抑制肿瘤细胞生长,诱导肿瘤自噬,显著抑制mTOR通路和MYC癌蛋白。作为I类HDAC抑制剂,VPA可通过抑制HDAC1增加他西罗莫司促自噬的作用。应用小分子干扰(siRNA)阻断HDAC1可拮抗VPA介导的CDKN1A、CDKN1B和LC3-I/II调控、肿瘤生长抑制和肿瘤细胞自噬。同时,VPA可通过抑制HDAC3抵消他西罗莫司诱导的AKT激活。HDAC3 siRNA可拮抗VPA调控AKT磷酸化、肿瘤生长抑制和肿瘤细胞自噬。此外,在原代肿瘤细胞中,两药联合有显著地协同作用,但不影响正常的造血细胞的生长。在Namalwa细胞构建的小鼠Burkitt淋巴瘤/白血病移植瘤模型中,两药联合能有效阻断肿瘤生长,抑制MYC和诱导原位自噬。上述研究结果证实了HDAC和mTOR抑制剂对Burkitt淋巴瘤/白血病的协同作用,同时也显示靶向自噬在治疗MYC相关恶性淋巴细胞疾病中的应用前景。
在T细胞恶性淋巴细胞疾病中,MYC癌蛋白也在肿瘤发生发展中具有关键作用。然而,MYC在该疾病中的调控分子机制和靶向治疗策略亟待研究。微小RNAs(miRs)可调控抑癌基因和/或癌基因。在外周T细胞淋巴瘤非特指性(PTCL-NOS)中,miR187显著高表达,并与高肿瘤Ki67指数、高血清LDH水平、高临床IPI分期和患者不良预后相关。miRNA187在T淋巴瘤细胞株中的高表达可显著促进肿瘤细胞增殖,而特异抑制miR187能降低肿瘤细胞生长。作为重要的调控分子机制,miR187下调抑癌基因Dab2,减少Dab2和Grb2的相互作用,导致Ras激活、ERK和AKT磷酸化/激活,以及MYC癌蛋白的稳定性改变。MiR187高表达细胞对多种化疗药物耐药,包括阿霉素、环磷酰胺、顺铂和吉西他滨,但对蛋白酶体抑制剂硼替唑米敏感。硼替唑米可通过下调miR187、去磷酸化ERK和AKT、降解MYC而抑制T淋巴瘤细胞增殖。在Jurkat细胞构建的小鼠移植瘤模型中,硼替唑米对miR187高表达肿瘤的抑制作用更强,并伴有miR187、Ki67和MYC表达的显著下调。上述结果提示miR187通过调控Ras介导的ERK/AKT/MYC通路,与PTCL-NOS的肿瘤进展密切相关。虽然本身为致癌性,但miR187高表达的T淋巴瘤细胞却对生物靶向药物硼替唑米敏感。因此,联合靶向ERK和AKT也是临床治疗MYC相关恶性淋巴细胞疾病极具潜力的治疗策略。
年度发表论文
1.    Yan ZX, Wu LL, Xue K, Zhang QL, Guo Y, Romero M, Leboeuf C, Janin A, Chen SJ, Wang L, Zhao WL. MicroRNA187 overexpression is related to tumor progression and determines sensitivity to bortezomib in peripheral T-cell lymphoma. Leukemia 2013; doi:10.1038/leu.2013.291.
2.    Dong LH, Cheng S, Zheng Z, Wang L, Shen Y, Shen ZX, Chen SJ, Zhao WL. Histone deacetylase inhibitor potentiated the ability of MTOR inhibitor to induce autophagic cell death in Burkitt leukemia/lymphoma. J Hematol Oncol 2013;6:53. doi: 10.1186/1756-8722-6-53.
3.    Jiang XX, Yan ZX, Song YY, Zhao WL. A pooled analysis of MRI in the detection of bone marrow infiltration in patients with malignant lymphoma. Clin Radiol 2013;68:e143-53.
4.    Zhao X, Zhang W, Wang L, Zhao WL. Genetic methylation and lymphoid malignancies: biomarkers of tumor progression and targeted therapy. Biomarker Research 2013; 1:24
 
2013年,本课题组通过研究主要发现腺苷酸环化酶9(AC9)可以受miR-181a的靶向调控,并影响急性早幼粒白血病细胞(APL)的分化。
我们之前的研究表明,cAMP/PKA信号通路在全反式维甲酸(ATRA) 诱导APL细胞分化过程中发挥了重要的作用。腺苷酸环化酶(AC)能够催化ATP转化为cAMP,从而上调细胞内cAMP的水平。目前已知在人类中AC共存在10个亚型。基因芯片的结果表明AC9亚型在APL细胞株NB4中表达相对较高。于是,我们对AC9在APL细胞分化中的作用进行了深入研究。通过过表达和基因沉默实验,我们发现AC9蛋白的确可以上调细胞内cAMP的水平,并能促进维甲酸受体a (RAR)的转录激活作用。在NB4细胞中稳定干扰AC9基因,可以明显抑制由ATRA诱导的NB4细胞分化。与对照相比,干扰了AC9基因的NB4细胞用ATRA处理后,CD11b的表达和NBT的还原能力均明显下降。这些结果表明AC9在ATRA诱导的APL细胞分化过程中的确发挥了非常重要的作用。进一步,我们又分别对维甲酸敏感的NB4细胞和维甲酸耐药的APL细胞株NB4-R1中的AC9表达情况进行了检测,结果发现两株细胞中AC9 mRNA水平没有明显的差异,但NB4细胞中AC9的蛋白水平则明显高于NB4-R1,这提示AC9蛋白可能受到基因转录后水平的调控。MicroRNA是基因转录后调控的一种重要方式。通过对NB4及NB4-R1细胞中MicroRNA表达芯片的比较,并根据生物信息学软件的预测,我们发现miR-181a在两株细胞中有明显的表达差异,并且与AC9 mRNA的3'UTR区具有一定的互补性。报告基因实验及基因过表达实验证明miR-181a的确能和AC9 3’UTR区结合并明显下调AC9蛋白的水平。为了进一步研究miR-181a在NB4和NB4-R1中差异表达的分子机制,我们对miR-181a基因启动子序列进行了分析,并通过Chip实验证明CEBP能够和miR-181a启动子序列发生结合。在293T细胞中过表达CEBP可以明显抑制miR-181a的表达水平。此外,我们还收集了部分APL患者的骨髓原代细胞,并对其AC9和miR-181a的表达水平分别进行了检测。RT-PCR以及实时定量PCR的实验结果表明,初发及复发APL病人的AC9表达水平明显低于治疗后完全缓解及非白血病病人,而miR-181a的表达水平则正好相反,两者的表达呈现出明显的反相关性,并且和白血病的发生有一定的关联性,提示AC9和miR-181a有可能作为潜在的白血病临床诊断和治疗的生物学标记,具有一定的临床意义。
本课题组也对其他类型的白血病开展了研究。MLL白血病是一种常见的急性白血病,预后极差,目前临床上尚无有效治疗手段,亟待开发新型治疗策略。MLL融合基因作为MLL白血病的驱动因素,与多数癌基因相似,除了肿瘤促进活性外,还拥有内在肿瘤抑制活性,表现为过表达时抑制肿瘤生长和促进细胞凋亡。我们在多年从事MLL白血病发病机制研究的基础上,发现蛋白酶体抑制剂可以促进MLL融合蛋白在白血病细胞内的进一步积累,使得内在肿瘤抑制活性成为其主要功能,从而特异地促进MLL白血病细胞发生凋亡,达到靶向治疗的目的。这说明利用MLL融合基因的内在肿瘤抑制活性进行MLL白血病的靶向治疗在理论和实践上是可行的。有趣的是,只有表现为B-ALL而非AML的MLL白血病细胞,才对蛋白酶体抑制剂高度敏感。我们正对蛋白酶体抑制剂特异地在B-ALL的MLL白血病细胞中诱发内在肿瘤抑制活性,诱导细胞凋亡的分子机制进行深入研究,并且对该新型靶向治疗策略进行临床前研究,为其临床转化应用打下基础。
年度论文发表:
Xu GP, Zhang ZL, Xiao S, Zhuang LK, Xia D, Zou QP, Jia PM, Tong JH. Rig-G negatively regulates SCF-E3 ligase activities by disrupting the assembly of COP9 signalosome complex.Biochemical and Biophysical Research Communications 2013;432: 425-430.
 
六、血友病基因治疗和白血病免疫治疗基础研究(奚晓东)
血栓与止血研究课题组现有两个主要的研究方向即一、血栓与止血过程相关的信号转导和调控机制的研究;二、凝血因子及遗传性出血病和血栓病的研究。这两个主要研究方向在2013年中均获得了实质性的进展。
在整合素αIIbβ3双向信号转导及分子机制研究方面,我们的研究重点集中RGT肽在整合素外向内信号转导中的作用及其分子机制,并在对其作为抗血栓制剂的重要特性和作用进行了深入探讨,特别是RGT肽对c-Src功能以及相应血小板功能的影响。确定了活化的c-Src能直接磷酸化整合素β3胞浆段酪氨酸,而这种催化作用不依赖于其与β3末端RGT序列的结合;胞浆内RGT肽可影响整合素信号转导及相应血小板功能而不依赖于膜锚定;RGT肽与c-Src的结合并不直接影响后者的激酶活性,但能抑制整合素αIIbβ3外向内信号转导介导的活化;RGT肽对血小板聚集的抑制作用在高剪切力下更为显著,说明其通过选择性阻断外向内信号转导主要影响血小板的稳定粘附和不可逆聚集,进而影响血栓的稳定性。此项工作向第55届美国血液学会(ASH)年会投稿,获得摘要成就奖(Abstract Achievement Award)。目前已完成论文撰写,准备向国际学术期刊投稿。另外,在与其他课题组合作,获得了RGT肽与c-Src的SH3结构域相互作用的蛋白晶体学数据的基础上,寻找到120个具有类似结构的小分子物质。初步功能筛选结果提示,12个小分子具有抑制外向内信号转导的功能,其中2个有明显的选择性作用。此项工作展现了较好的前景,后续研究正在积极推进。
围绕出血病和血栓病的基础与临床研究,本年度进一步探讨了遗传性出血病的分子诊断新策略,包括AccuCopy技术检测拷贝数变异(CNVs),异位转录结合定量分析各种剪接体解释剪接位点突变导致血友病不同严重程度等。同时,通过蛋白结构与功能关系的研究解释了FX Thr211Pro突变致病的独特分子致病机制。遗传性易栓症方面主要对导致静脉血栓的两种重要的抗凝因子(蛋白C和抗凝血酶)在中国人中静脉血栓形成中的作用及中国人中的基因突变谱进行了研究,并发现中国人(特别是年轻人)反复静脉血栓的发生与蛋白C双杂合突变及抗凝血酶单一杂合突变相关。下一步将结合快速发展的分子诊断技术,利用已有的遗传性出血病和血栓病的病例资源,建立相应的分子诊断体系。
2013年共完成SCI论文(医学基因组学国家重点实验室为第一作者单位)3篇以及一些非第一作者单位SCI论文或国内核心期刊论文。
年度发表论文
1.    Zhou JW, Liang Q, Chen Q, Xie Y, Ding QL, Wang XF, Xi XD, Wang HL. Molecular defects in the factor X gene caused by novel heterozygous mutations IVS5+1G>A and Asp409del. Haemophilia 2013; 19:94-9
2.    Liang Q, Chen Q, Ding Q, Wu F, Wang X, Xi X, Wang HL. Six novel missense mutations causing factor X deficiency and application of thrombin generation test. Thrombosis Research 2013; 131:554-9
3.    You GL, Ding QL, Lu YL, Dai J, Xi XD, Wang XF, Wang HL. Characterization of large deletions in the F8 gene using multiple competitive amplification and the genome walking technique. Journal of Thrombosis and Haemostasis 2013; 11:1103-10
 
1. miR-34b 在斑马鱼器官发生过程中调控多纤毛形成
多纤毛细胞是一种在脊椎动物中分布广泛的细胞,特点是在细胞表面有几十到上百个毛状突起——纤毛,这些纤毛可以有序地摆动从而调节液体的流动。多纤毛细胞在人体主要负责清除吸入的异物和呼吸道分泌物、维持脑脊液的流动和帮助卵子运输。但目前对于多纤毛细胞的纤毛发生的调控机制仍然知之甚少。miR-34小RNA家族是重要的抑癌基因,但其生理功能仍不清楚。以斑马鱼为模式生物我们发现,在胚胎发育过程中miR-34b富集表达在肾脏和嗅球的多纤毛细胞中。miR-34b的缺失会导致纤毛发生障碍并进而引起肾脏发育的异常。进一步机制分析表明,在纤毛发生的过程中,转录因子cmyb的表达对于中心粒复制的启始是非常重要的,调控着plk4和stil等重要基因的表达;但cmyb的持续表达会使中心粒始终处于复制的状态,阻碍中心粒向细胞膜的移位和纤毛的生长。miR-34b功能就是在中心粒复制结束后使cmyb的表达水平降低,结束中心粒的复制,促使中心粒从胞浆运输到细胞膜,然后开始纤毛的生长。以上结果首次揭示了miR-34b在多纤毛细胞发育过程中的重要功能及其相关的信号通路,增进了我们对多纤毛细胞的纤毛发生过程的了解,并有望为治疗纤毛相关疾病带来新的策略和靶点。相关工作成果今年已在国际学术期刊《Development》上发表。
2. 组蛋白去甲基化酶Jmjd3通过和C/EBPβ的相互作用控制PU.1 的表达调控髓系前体细胞的分化
    PU.1的表达代表了髓系发生关键的分子生物学事件,PU.1的下调可能导致急性髓系白血病的发生。然而,在髓系命运决定过程中PU.1的转录调控还不清楚。我们的结果显示,一种含有JMJC结构域的组蛋白H3K27去甲基化酶Jmjd3,对于斑马鱼和哺乳动物髓系前体细胞的发育是至关重要的的。Jmjd3和C/EBPβ相互作用,共同占据PU.1上游一段高度保守的调控元件,通过降低其H3K27me3的水平促进染色质构象的激活。我们的结果证明了Jmjd3通过促进PU.1的表达在髓系前体细胞分化过程中发挥关键作用。
3. ENU突变斑马鱼家系的测序和保种工作
利用斑马鱼模式生物,通过化学诱变技术进行“前向”遗传学筛选是研究脊椎动物发育的一个有力手段。之前的研究通过染色体步移技术从众多随机突变中鉴定致病性变异仍是耗时费力的工作。最近,我们首次尝试通过斑马鱼外显子捕获结合高通量的二代测序技术进行一例m792突变家系的分析,这例突变以定向造血缺陷为异常特征。我们共收集了来自TU突变和WIK品系杂交获得的20个纯合突变胚胎,辅以其父鱼母鱼作为参照,通过Agilent 斑马鱼外显子组捕获芯片结合Illumina GAIIx进行二代测序,在纯合突变子代中获得覆盖斑马鱼编码区域70倍以上的测序深度,综合预测的重组率、测序获得的变异、突变家系父鱼母鱼的基因组序列等信息后,将致病区域定位到19号染色体3-3.8 Mb的位置(基于斑马鱼参考序列USCS DanRer7版本)。通过进一步细化分析其中的基因序列,初步提示RECQL4基因的终止密码突变是可能的致病位点。进一步的功能验证分析正在进行中。此外,经过前期条件摸索,平台已成功掌握精子冻存方法,冻存的精子复苏率可维持在25%左右,现已陆续开展突变家系的保种工作。
年度发表论文
1.  Liu YJ, Fan HB, Jin Y, Ren CG, Jia XE, Wang L, Chen Y, Dong M, Zhu KY, Dong ZW, Ye BX, Zhong Z, Deng M, Liu TX, Ren RB. Cannabinoid Receptor 2 Suppresses Leukocyte Inflammatory Migration by Modulating the JNK/c-Jun/Alox5 Pathway. The Journal of Biological Chemistry 2013;288:13551-62.
2.  Wang L, Fu C, Fan HB, Du TT, Dong M, Chen Y, Jin Y, Zhou Y, Deng M, Gu AH, Jing Q, Liu TX, Zhou Y. miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish. Development 2013;140:2755-64.
3.  Ren CG, Wang L, Jia XE, Liu YJ, Dong ZW, Jin Y, Chen Y, Deng M, Zhou Y, Zhou Y, Ren RB, Pan WJ, Liu TX. Activated N-Ras signaling regulates arterial-venous specification in zebrafish. Journal of Hematology & Oncology 2013; 6:34.
 
八、基因芯片的研制、应用和开发(张济)
肿瘤的调控最终汇集于染色质的高维结构。因此,全面而系统地挖掘蕴藏于这种染色质高维结构中的多层面信息对于深刻理解肿瘤至关重要。在过去的十数年中,本课题组的研究重点主要集中在应用多组学手段研究肿瘤的基本问题,如恶性增殖与自我更新、分化以及凋亡等,以达到从全局的角度了解这些问题的根本机制。就研究对象而言,本课题组主要以APL以及CML作为研究模型,并就其在不同条件下细胞内的分子活动进行系统性的研究。例如,本课题组在先前的研究工作中发现:PML/RARa这一促使APL发生的根本因子在其形成后,选择性的与位于染色质上的PU.1转录因子进行结合,从而对PU.1所调控的靶基因产生抑制。由于PU.1是粒系分化中的关键性因子,所以PML/RARa与其在染色质上的选择性结合也就解释了为什么PML/RARa可以造成粒系分化受阻的原因。有趣的这种选择性结合不仅需要PML/RARa与PU.1间的蛋白-蛋白相互作用,而且需要PML/RARa与附近DNA 序列中的RAREh位点结合。最近我们的工作有发现:造成这种选择性结合的第三种因素是与PU.1相互作用的顺式DNA调控元件。当然,决定这种PML/RARa与PU.1选择性结合的更多因素还蕴藏在影响染色质高维结构的各类表观基因组学层面修饰。而这方面也正是本课题组目前研究的方向。相信这方面研究的深入将会给我们的肿瘤研究带来全新的思维方式及研究理念。在有关CML的研究中,我们通过多组学手段发现fenretinide这种化合物可以有效地杀灭非增长性的CML干细胞。随后的工作又发现其对于一些AML亚型中的非增长性干细胞以及部分实体瘤中的非增长性干细胞也同样具有杀灭作用。
另外,筛选和发现肿瘤标志物以及潜在的抗癌药物也是本课题的研究重点。通过组学与分子生物学方法相结合的策略,目前已发现了一批具有潜在价值的肿瘤标志物及药物。而这方面工作的深入将会为我们在不远的将来开发良好的肿瘤诊断、预后监测以及治疗方案奠定基础。
1.    Du YZ, Xia Y, Pan XL, Chen Z, Wang AH, Wang KK, Li JM, Zhang J. Fenretinide Targets Chronic Myeloid Leukemia Stem/Progenitor Cells by Regulation of Redox Signaling. Antioxidants & Redox Signaling 2013; PMID:24021153 Epub ahead of print.
2.    Qian MX, Jin W, Zhu XH, Jia XH, Yang XW, Du YZ, Wang KK, Zhang J. Structurally differentiated cis-elements that interact with PU.1 are functionally distinguishable in acute promyelocytic leukemia. Journal of Hematology & Oncology 2013;6:25. doi:10.1186/1756-8722-6-25.
3.    Xia Y, Fang H, Zhang J, Du YZ. Endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis in imatinib-resistant leukemic K562-r cells triggered by AMN107 combined with arsenic trioxide. Experimental Biology and Medicine (EBM) 2013;238:932-42. doi: 10.1177/1535370213492689
4.    王果,邓望龙,张济. c-Myb在急性早幼粒白血病发病过程中的作用. 上海交通大学学报(医学版)2013;546
 
九、基因调控课题组(王侃侃)
本课题组主要通过整合高通量组学技术和细致的分子、动物模型层面研究来揭示疾病的发生和治疗机制。首先,通过ChIP-seq和RNA-seq等组学技术和生物信息学分析方法揭示t(8;21)染色体易位形成的融合蛋白AML1-ETO在全基因组水平的结合模式。其次,以异常融合蛋白调控的CTSG、PSMBs等关键基因的调控机制为切入点,揭示白血病发生累及的异常功能通路。再次,通过分子生物学、细胞生物学和动物实验研究小分子化合物特异性诱导AML白血病干细胞凋亡的特性及潜在机制。
在高通量组学层面,本课题组本年度主要聚焦于研究AML1-ETO在全基因组水平的结合特点。AML1-ETO是t(8;21)染色体易位引起的M2b型白血病发病的关键因素之一。因此,深入研究AML1-ETO在全基因组范围内的结合特征以及对其靶基因的异常转录调控机制对揭示M2b型白血病的发病机制提供极有力的帮助。目前普遍认为,AML1-ETO主要通过AML1部分的RHD结构域结合到基因组上,通过ETO部分的抑制结构域异常调控AML1以及一些关键造血转录因子靶基因的表达。因此,我们分别利用AML1和ETO特异性的抗体进行ChIP-seq实验。结果显示大部分AML1-ETO能够与野生型AML1在共同靶序列上结合,进一步实验发现AML1-ETO和AML1可以通过RHD domain直接相互作用,这就对目前AML1-ETO参与调控AML1靶基因的转录调控机制提出了一个潜在的机制。同时结合表达谱数据分析,结果提示AML1-ETO除了对基因表达有抑制作用,还存在激活效应,这些结果都对研究AML1-ETO致病机理提供了有力线索。此外,我们还结合前期研究结果,利用ChIP-seq技术对APL中关键转录因子PU.1的全基因组范围内结合特征进行了进一步的研究。结果显示,PU.1富集的片段具有既分布在启动子区域又存在增强子区域的双重特征。转录因子结合位点扫描结果进一步提示PU.1存在两种不同特征的motif (长motif和短motif)。其中长motif具有很高的序列特异性及结合亲和性,分布具有双重特征;而短motif则具有多样性,主要分布在启动子区域,更倾向与其他转录因子共同调控的特征,如PML-RARα。这一研究提示在APL的发生过程中,PML-RARα通过选择性结合PU.1的位点而导致分化受阻(2013 Journal of Hematology & Oncolog)。组学研究过程中我们还开发了一个基因调控网络的建模软件GeneCircuits,通过建立数学模型来有效整合系统中多层次的信息并建立其定量依存关系(2013 PLoS One)。
深入细致地研究白血病发生过程中累及的关键基因的转录调控机制对于揭示白血病发生机制同样重要,不仅能为揭示白血病累及的异常调控网络提供重要的理论基础,还能为优化临床治疗方案提供更多的潜在靶点和功能通路。我们通过对AML病人表达谱芯片分析发现对细胞具有防御功能的中性粒细胞特有的丝氨酸蛋白酶家族成员中CTSG在AML1-ETO阳性病人中较AML1-ETO阴性病人的表达水平明显降低。进一步的分子生物学实验揭示了AML1-ETO有别于以往报道的转录抑制机制:即AML1-ETO通过结合于不同于野生型AML1的结合位点而抑制CTSG的表达。更有意义的是,通过功能研究我们还发现CTSG可以在体内和体外对AML1-ETO进行酶切促其降解,且CTSG的表达量直接影响到白血病细胞的分化、生长和凋亡等生物学效应。这一研究提出了一种白血病细胞逃避细胞内防御而促成白血病发生的可能机制(2013 Oncogene)。另外,T淋巴细胞成功地识别和杀伤肿瘤细胞的关键之一是肿瘤细胞的抗原有效地呈递给T细胞。干扰免疫蛋白酶体亚基PSMB8、PSMB9、PSMB10(PSMBs)在高效的抗原呈递过程中发挥了重要的作用。通过染色质免疫沉淀实验、双荧光报告基因实验等一系列地研究,我们发现PML-RARα能特异性地抑制PSMBs在APL中的表达,从而干扰免疫调节系统。机制研究发现这种异常转录调控是通过特异性抑制PU.1对这些PSMBs激活效应从而发挥作用。更有意思的是,这三个基因坐落在两条染色体的不同位置,PML-RARα和PU.1通过远程调控机制协同调节了染色体内和染色体间的基因表达。进一步在ATRA治疗APL过程中,ATRA能恢复PMSBs的表达,使得T淋巴细胞能更加有效的识别APL细胞(部分结果发表于2013 Oncogene)。
虽然通过优化临床用药方案使得某些类型白血病的治疗取得了较好的进展,然而临床治疗过程中耐药以及复发仍是导致死亡的主要因素。目前研究提示白血病干细胞逃避常规的化疗药物是临床上白血病耐药和复发的主要原因。然而有效地靶向白血病干细胞的药物却非常缺乏。通过建立高通量组学平台,我们前期研究了若干诱导白血病细胞和分化的药物的分子机制,发现小分子化合物Fenretinide通过激活细胞内ROS水平上调的应急相关调控因子NRF2和HSF1而诱导白血病细胞凋亡。受白血病干细胞和正常造血干细胞对ROS敏感性不同的启发,应用临床白血病病人原代细胞、动物植瘤实验等进行实验,我们进一步发现Fenretinide可靶向杀伤白血病干细胞而对正常干细胞无杀伤作用。生物信息学分析发现,Fenretinide靶向调节的基因正和临床预后不良的基因密切相关。本研究不仅为临床药物联用提供了新的策略和理论依据,而且为进一步开发更有效的靶向化合物提供了新的思路(2013 PNAS)。
年度论文发表:
1.    Yang X, Wang P, Liu J, Zhang H, Xi W, Jia X and Wang K, Coordinated regulation of the immunoproteasome subunits by PML/RARa and PU.1 in acute promyelocytic leukemia.  Oncogene 2013 Jun 17. doi: 10.1038/onc.2013;224. [Epub ahead of print].
2.    Zhang H, Mi J, Fang H, Wang Z, Wang C, Wu L, Zhang B, Yang W, Wang H, Minden M, Li J, Xi X, Chen S, Zhang J, Chen Z and Wang K, Preferential eradication of acute myelogenous leukemia stem cells by fenretinide . Proc Natl Acad Sci USA 2013;110:5606-11
3.    Jin W, Wu K, Li Y, Yang W, Zou B, Zhang F, Zhang J and Wang K, AML1-ETO targets and suppresses cathepsin G, a serine protease, which is able to degrade AML1-ETO in t(8;21) acute myeloid leukemia. Oncogene 2013;32: 1978-87.
4.    Luo R, Ye L, Tao C, Wang K. Simulation of E. coli gene regulation including overlapping cell cycles, growth, division, time delays and noise. PLoS One 2013;8:e62380.
5.    Qian M, Jin W, Zhu X, Jia X, Yang X, Du Y, Wang K and Zhang J. Structurally differentiated cis-elements that interact with PU.1 are functionally distinguishable in acute promyelocytic leukemia. Journal of Hematology & Oncology 2013;6:25.
 
2013年度在新建结构生物学实验室在完善平台建设的同时建立了合理的管理制度,取得了阶段性成果,包括:1)依赖现有的设备和技术,基本能完成从基因到蛋白结构的解析;2)建立了包括中(包括上海光源)、英、美、欧洲的国际合作团队,利用多领域和多学科的交叉融合,对流行性疾病(特别是在革兰氏阴性菌的毒性蛋白分泌系统和病原菌与宿主结合机理方面)和某些血液疾病相关基因结构和功能进行系统、细致的研究;3)目前已取得了一些阶段性成果(Cai et al, 2011, Meng et al, 2011, Xiao et al, 2013)。本课题组的主要研究方向有:
1. 流感嗜血杆菌的发病机制
通过研究流感嗜血杆菌整合素的作用机制,从结构生物学的水平阐述流感嗜血杆菌与人类宿主细胞结合的机理,从而为研发针对该类细菌的新型的低抗药性的小分子化合物药物提供生物学的依据。
2. 革兰氏阴性菌自转子分泌系统
据已知数据,大约有700多个革兰氏阴性菌毒素都通过该分泌系统分泌到细菌体表从而赋予细菌吸附于宿主并逃避宿主免疫系统吞噬的能力。为药物研发提供生物学依据。
3. 革兰氏阴性菌协助外膜蛋白的插膜系统
该跨膜蛋白聚合物系统,是外膜合成的重要组成部分,抑制该系统将能有效抑制革兰氏阴性菌的生长。因此,对该聚合物的理解,将有助于研发针对革兰氏阴性菌病原体的高效抗生素。
4. 依托国家重点实验室,与其他研究组充分合作,主要开展恶性血液病相关的蛋白结构,如PML-RARa与砷结合的结构解析,AML-ETO, NUP98-IQCG, Src:integrin (Xiao et al, 2013)等与血液病密切相关的致病基因和/或药物靶点研究,从结构生物学进一步阐述白血病发病原理和小分子药物(Structure-based drug design)的筛选。
2013年度代表性工作是:
揭示了一种新的非经典SRC激酶活化机制
Src是最先发现的致癌基因之一。Integrin介导的c-Src活化和血栓的形成、肿瘤细胞的迁移相关联。一般情况下,c-Src由其SH3结构域和富含脯氨酸的蛋白序列(PXXP motif)结合而活化。Integrin利用其胞内C末端的RGT来激活c-Src。由于结构数据的缺失,RGT如何结合SH3,又如何激活c-Src,一直是悬而未决的问题。我们报道了分辨率达2.0埃的SH3:RGT复合物晶体结构。结构显示,RGT结合在SH3的“N”-Src loop。体内外的功能实验表明,“N”-Src loop的突变,将影响RGT和SH3的结合以及integrin介导的c-Src活化。最后,我们提出了新的非经典的c-Src的活化机制模型。 研究成果《Structural framework of c-Src activation by integrin b3 》在线发表于2013年1月国际学术期刊《Blood》(影响因子:10.5), 被相关领域专家认为: “provides a new model to explain how the b3  integrin cytoplasmic tail activates c-Src tyrosine kinase” and “the mechanism is distinct from other activation mechanism currently described”. 特别是血小板研究同行认为b3 -bound c-Src is thought to be: “activation of responsible of aIIbb3 -mediated “outside-in” signalling in platelets. Thus, solving the structural basis for c-Src binding to b3 is an advance in understanding this aspect of platelet function.”
年度发表论文
Xiao R, Xi XD, Chen Z, Chen SJ, Meng G. Structural framework of c-Src activation by integrin β3. Blood 2013;121:700-6
 
十一、肿瘤靶向治疗研究(任瑞宝)
近年来肿瘤全基因组的大规模测序结果进一步揭示了肿瘤遗传变异的高度复杂性。肿瘤靶向治疗研发面临以下主要挑战:1.多数肿瘤细胞有多个肿瘤驱动突变基因;2.肿瘤异质性及肿瘤进化;3.多数肿瘤驱动突变基因难以成为治疗靶点。我们致力于研究癌基因和抑癌基因在肿瘤发生发展中的作用机制及其调控网络节点,找出这些关键节点上可以作为治疗靶点的重要调控蛋白,研发针对这些关键节点的联合靶向治疗方案。同时我们也与其他课题组合作,研究肿瘤细胞信号转导和表观遗传在肿瘤发生发展中的相互作用。
(一)RAS相关肿瘤靶点鉴定
    RAS异常激活与许多恶性肿瘤的发生发展密切相关。但是,由于RAS的酶活性起“自我关闭”作用,且突变后因RAS鸟苷酸酶失活而将RAS锁在与GTP结合的激活状态,导致RAS蛋白本身无法成为抗肿瘤治疗的理想“靶点”。寻找可能阻抑RAS信号通路的靶点对于RAS相关肿瘤的治疗至关重要。我们的部分研究集中在RAS相关肿瘤的靶点鉴定,主要分2个方向。
1、棕榈酰转移酶在NRAS诱导白血病中的影响
    蛋白质棕榈酰化在调节膜定位、亚细胞转运和蛋白功能方面起重要作用,HRAS,NRAS,和KRAS4A的棕榈酰化修饰(Palmitoylation)是它们与质膜结合的基础。我们前期研究首次证明了棕榈酰化修饰是NRAS引起白血病过程是一个关键步骤,提示靶向棕榈酰化修饰的治疗可能对包括恶性血液肿瘤在内的NRAS相关肿瘤产生很好的治疗效果。靶向RAS棕榈酰化的化学干扰方法之一是抑制介导棕榈酰化的酶---棕榈酰转移酶(palmitoylacyltransferases , PATs)。目前为止,哺乳动物中已发现24种PATs,它们在生理和疾病中的作用尚未明确。DHHC9(全称含有364氨基酸的锌指蛋白)和GCP16全称复合体在体外具有棕榈酰化HRAS和NRAS 的功能。我们应用DHHC9基因敲除小鼠模型研究其在正常造血中的功能及在RAS恶性转化过程中所起的作用。结果显示,DHHC9缺失后小鼠造血系统无明显异常,但DHHC9敲除小鼠骨髓细胞表达NRAS肿瘤基因(NRASG12D)后生存期较野生型小鼠相对延长。我们的研究表明棕榈酰转移酶DHHC9在NRAS诱导的白血病发生过程中起一定作用,但不是其唯一的棕榈酰转移酶,揭示哺乳动物体内可能存在多个催化RAS棕榈酰化的PATs。相关文章已在整理中。
我们目前正在建立与肿瘤相关的棕榈酰转移酶DHHC14全称及DHHC19条件性敲除小鼠模型,预计2014年初拿到杂合子。
2、脂肪酸合成酶在正常造血系统和肿瘤发生中的作用
内源性棕榈酸从头合成的关键酶是脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase, FASN)。肿瘤细胞即使在有氧条件下仍以葡萄糖酵解为主要能量获取方式,而与糖酵解增强相应的代谢变化是脂肪酸的从头合成增加。脂肪酸是细胞膜形成、能量代谢、信号传导及蛋白质翻译后酯化修饰的基本要素。我们利用脂肪酸合成酶条件性敲除的小鼠模型研究其在正常造血和肿瘤发生中的作用机制。结果显示FASN缺失小鼠造血未见明显异常,预示FASN特异抑制剂对于正常造血系统的毒性较小。FASN在肿瘤发生过程中的作用仍在研究中。
(二)干扰素调节因子8(IRF8)抑癌机制研究
    干扰素是重要的天然抑癌因子,其作用主要由干扰素调节因子介导。IRF8(干扰素调节因子8)是由IFN-γ诱导的IRF家族成员转录因子之一。在CML病人中IRF8表达下调,IRF8基因敲除小鼠表现为慢性粒细胞白血病样(CML-like)疾病。IRF8-/-小鼠病程进展和人类CML一样,表现为慢性期、加速期、急变期(淋巴结可见70% B细胞,死于B-ALL)。我们研究发现胚胎16.5天(E16.5)髓系细胞在野生型和敲除组中无差异,但在新生敲除鼠骨髓中髓系比例明显增加,3周以上显著差异。但是这一表型在5-6月间发生逆转(6月龄小鼠髓系明显下降,B淋系增加),这与CML的疾病进展是一致的。我们将通过研究基因组及转录组改变,阐释其疾病发病与转变的机制。这一研究将为我们认识IRF8抑癌机制及白血病治疗提供理论基础。
(三)肿瘤靶向治疗研发
1、靶向RAS通路的肿瘤治疗研究
    我们建立了 RAS 靶向细胞毒性的筛选平台,筛选并发现了一系列抑制 RAS 通路的小分子化合物-AR 化合物,它们对RAS 转化白血病细胞株和多种人肿瘤细胞株具有很强的杀伤作用。我们将通过蛋白芯片和基因芯片技术,并利用小鼠模型,系统阐明AR化合物的抗肿瘤治疗机制,为 RAS 相关肿瘤的治疗提供新的分子靶点,也为AR化合物药物的开发奠定理论和实践基础。
2、NADA的抗肿瘤作用研究
RAS蛋白的生物活性依赖于脂修饰,且RAS可以调节肿瘤细胞中的脂类代谢,所以我们筛选了一个活性脂类分子库并发现化合物N-花生四烯酸多巴胺(N-arachidonoyl dopamine , NADA)具有抗肿瘤活性。NADA属于大麻素。大麻素是一类具有包括抗炎作用在内的多种生理活性的化合物,它们通过大麻素受体发挥作用。但是,在我们的筛选体系中,NADA的抗肿瘤活性可能与大麻素受体无关。我们还分析了NADA对RAS信号通路以及RAS转化细胞中基因表达情况的影响。这些研究可能给研发针对RAS相关肿瘤的药物予以启发。
年度发表论文:
Liu YJ, Fan HB, Jin Y, Ren CG, Jia XE, Wang L, Chen Y, Dong M, Zhu KY, Dong ZW, Ye BX,  Zhong Z, Deng M, Liu TX and Ren RB. Cannabinoid receptor 2 suppresses leukocyte inflammatory migration by modulating the JNK/c-Jun/Alox5pathway. J Biol Chem 2013; 288:13551-62.
 
十二、以iPS细胞来源的HSC进行血小板特异的血友病A基因治疗(章国卫)
2013年度本课题组的主要工作是进行实验室建设及血友病A基因治疗的研究启动工作。本项研究以FVIII基因敲除小鼠为血友病A小鼠疾病模型,结合iPS细胞技术和血小板特异的血友病基因治疗技术,探索血友病A基因治疗的新途径。建立将小鼠成纤维细胞重编程为iPS细胞,经过基因改造后进一步诱导成为HSC并应用于血友病A的基因治疗新路线。血小板特异性的αIIb启动子控制下的FVIII基因将转入血友病A iPS细胞中,成功转基因后的iPS细胞将被筛选和诱导成为HSPC并移植进入受体血友病A小鼠体内,这些HSC将在小鼠体内分化成为包括血小板的各种血细胞,而FVIII将只在血小板中特异表达并储存在α颗粒中。当血小板在出血部位被激活时,储存在α颗粒中的FVIII将被释放出来参与促凝血过程达到止血的目的。这样可以提高在出血部位FVIII的局部浓度,更有利于止血,同时由于血小板的保护可使FVIII不受中和抗体抑制,使得在中和抗体存在的情况下仍可发挥止血功能。
主要的科研工作进展:
1. 慢病毒载体大规模制备平台建立
    建立了基于滚瓶培养装置的大规模细胞培养平台可同时培养35000 cm2的细胞,已用于慢病毒载体的大规模制备。同时建立了慢病毒载体滴度鉴定的多种方法:virus RNA titration、DNA titration、mRNA titration 以及表达蛋白分析等方法。
2. 血友病小鼠模型及与NOD/SCID小鼠交配繁殖,建立了动物实验相关方法与技术
    血友病A小鼠模型(FVIII基因敲除小鼠)及血友病B小鼠模型(FIX基因敲除小鼠)已在动物中心顺利繁殖,经活性测定和生理功能分析表明两种小鼠都具备典型的血友病症状。血友病A小鼠已与NOD/SCID小鼠交配获得F1代F8+/--NOD-SCID+/-,现F1雌鼠与NOD-SCID雄鼠继续交配产生F2代。
    动物实验技术方面,建立了小鼠尾静脉高压注射方法、tail-cut survive test和tail-bleeding test方法,确定了小鼠x射线辐照致死剂量等,为今后的动物实验奠定了基础。
3. hFVIII 基因密码子优化及其初步鉴定
    获得了经密码子优化后的人FVIII cDNA(op-F8),经体外转染293T细胞初步结果显示具有比野生型hFVIII cDNA更高的表达效率。此外,已建立了FVIII:C assay和FVIII:Ag assay。构建了op-F8慢病毒表达载体,现正在生产op-F8 慢病毒。
4. iPSC培养平台建立并初步尝试了ESC/iPSC向HSPC的诱导分化
初步建立了iPSC的培养技术与平台,可饲养基于MEF细胞的小鼠iPSC和ESC;建立了iPSC标志蛋白免疫荧光检测方法。尝试了通过悬滴法产生拟胚体(EB)并进一步在OP9细胞层上定向分化到HSPC,观察到部分HSPC标志物表达但尚未得到明确结果。已构建了hHoxB4逆病毒载体并建立了hHoxB4逆病毒的制备及滴度测定方法,待进一步提高逆病毒制备的质量后用于对拟胚体进行感染促使其体外向HSPC的诱导分化。在金颖实验室的帮助下,我们已初步获得由血友病A小鼠成纤维细胞诱导产生的iPS细胞,正在对所获得的iPS细胞进行功能鉴定及进行向HSPC定向分化的尝试。
 
十三、造血干细胞发育和重编程的研究(孙晓建,黄秋花)
1. 基于体细胞重编程和转分化技术获得病人特异的造血干细胞的研究
造血干细胞是各种血细胞的始祖细胞,担负着维持和重建造血的重要生理功能。造血干细胞移植作为临床治疗白血病和再生障碍性贫血等难治性血液系统疾患以及其它组织癌症的有效手段被广泛应用。我们的总体目标是基于细胞重编程原理,发展体外诱导和扩增病人特异的造血干细胞的技术,从而得到安全有效且不会发生免疫排斥的造血干细胞,并阐明其关键分子机制。首先,我们建立了小鼠和人的胚胎干细胞(ESC)和诱导多潜能干细胞(iPSC)的培养及诱导分化体系,并尝试了非整合载体系统诱导体细胞重编程的实验,对该过程进行深入分析将有助于我们对造血干细胞的分化和转分化过程的理解。另外,我们还克隆了一系列可能在造血转分化过程中起关键作用的调控因子,并构建了一个包含DNA条形码的逆转录病毒载体系统,该系统将用于筛选新的造血转分化关键因子。
2. Hypb/Setd2 在小鼠胚胎干细胞分化中的作用
SETD2/HYPB已被熟知是组蛋白 H3K36三甲基转移酶,然而其在正常细胞中的功能,如胚胎干细胞自我更新和定向分化中的作用机制尚不清楚。在此研究中,我们发现 Setd2 主要调控原始内胚层分化,但不影响其它胚层分化以及胚胎干细胞的自我更新。在分子水平上,Setd2 在小鼠胚胎干细胞中参与调节 Erk 信号通路。Setd2缺如小鼠ESCs中Erk的活性可以影响内胚层相关基因的表达,提示 Erk 信号通路受阻是内胚层缺陷的主要原因。值得关注的是,Setd2 通过Fgfr3远端启动子区域的组蛋白H3K36me3直接影响 Fgfr3基因的转录起始调控,参与激活 Erk 通路,从而调节小鼠胚胎干细胞原始内胚层发育。此外,这种转录调控模式也为其他一些基因所需。