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血研所2012年度各课题组进展情况
发布日期:2012-11-01 浏览次数:542

一、白血病系统生物学(陈竺)
(一)冬凌草甲素靶向治疗AML-M2b白血病分子机制研究
许多研究证实AML1-ETO融合基因编码的融合蛋白在AML-M2b白血病发病中发挥重要作用, AML1-ETO融合蛋白由此也成为治疗该类白血病的重要药物靶点。目前,大约60%该类型的白血病患者不能获得长期的临床缓解。前期研究显示,冬凌草甲素(oridonin)可以选择性地诱导AML-M2b白血病细胞的凋亡并通过caspase-3依赖的途径剪切AML1-ETO并产生一个70KDa的剪切片段(ΔAML1-ETO),延长AML1-ETO9a发病小鼠的生存期。在进一步的研究中,我们发现冬凌草甲素可以与谷胱甘肽(glutathione, GSH)和硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin/thioredoxin reductase, Trx/TrxR)的巯基结合,迅速升高细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平,从而导致caspase-3的活化。并且,冬凌草甲素可以与AML1-ETO结合,并稳定已形成的ΔAML1-ETO,抑制其被caspase-3进一步降解。冬凌草甲素诱导产生的ΔAML1-ETO剪切片段可以通过NHR2结构域与AML1-ETO相互作用,干扰AML1-ETO的功能,解除AML1-ETO对其靶基因的转录抑制作用,扮演一个肿瘤抑制因子的功能。此外,冬凌草甲素还可以抑制c-Kit阳性的白血病起始细胞(leukemia-initiating cells, LIC)的活性,从而延长AML1-ETO9a小鼠的生存期;冬凌草甲素与全反式维甲酸和粒细胞集落刺激因子联合使用,可以协同打击白血病干细胞和延长AML1-ETO9a发病小鼠的生存期。这些研究结果提示,冬凌草甲素是一个潜在的白血病分子靶向治疗药物。相关研究结果发表于Science Translation Medicine
(二)急性早幼粒细胞白血病临床治疗方案的总结
急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia, APL)是急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia, AML)的一种特殊亚型。以往APL的治疗效果差,病情凶险,随着对APL发病机制认识的深入和治疗方法的不断改进,使其治疗结果和预后有了很大的改善,成为目前治疗效果最好的一种白血病亚型。应用全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA) 诱导分化治疗APL,大大降低了初发患者的高死亡率,显著提高了缓解率。目前,ATRA与蒽环类药物联合的化疗方案已成为传统的治疗方案, 同时大剂量的阿糖胞苷对于预防高危病人的复发有很好的效果。近期,通过将三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)从原来治疗复发患者拓展到一线治疗初发患者,我们发现对于ATRA联合ATO的治疗方案来说,鉴于其靶向治疗的机制、治疗毒性较小以及提高长期预后等优点,目前这种组合正成为新的标准治疗方案。通过讨论APL的治疗策略,包括对初发病人的新治疗方法,治疗副作用的处理,复发治疗等,我们总结了二十多年来上海血研所的治疗经验,制定出一个有中国特色、原创性的治疗方案供国内外同行参考,同时在目前较好的治愈率的基础上,为进一步提高疗效,我们提出针对APL初发患者,需要及时,全力以赴地给予最佳的治疗。通过上述系统地总结,我们规范和提升APL的治疗模式,发表于Leukemia
年度发表论文
1.         Zhen T, Wu CF, Liu P et al. Targeting of AML1-ETO in t(8;21) leukemia by oridonin generates a tumor suppressor-like protein. Science Translational Medicine 2012; 127(4): 127-138.
2.         Mi JQ, Li JM, Shen ZX et al. How to manage acute promyelocytic leukemia. Leukemia 2012; 26(8):1743-1751.
3.         Liu JX, Zhou GB, Chen SJ, Chen Z. Arsenic compounds: revived ancient remedies in the fight against human malignancies. Curr Opin Chem Biol 2012; 16(1-2):92-8.
 
二、白血病发病原理研究(陈赛娟)
(一)进行中国人群大样本急性淋巴细胞白血病核型分析与分子诊断回顾性分析
对1452例初发急性淋巴细胞白血病病例,从年龄分层、免疫表型、全面分子标志筛查、预后相关性等多方面深入分析。通过与西方国家文献比较,阐明了中国急性淋巴细胞白血病人群的临床特征与遗传学改变概貌与特点;并对急性淋巴细胞白血病分子遗传学异常进行危险度分层、提示临床预后。
1、中国人群初发急性淋巴细胞白血病(I):1346例儿童与成人病例遗传学概貌分析及与西
方国家之间的比较
白血病的诊断、治疗和预后评估很大程度上依赖遗传学异常的鉴定。我们对1346例中国人群急性淋巴细胞白血病病例的遗传学异常进行了系统回顾性研究。在儿童病例中,高二倍体、t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1发生率较高(P<0.0001);而在成人病例中,Ph、IKZF1基因的Ik6缺失转录本发生率较高(P<0.0001)。在B-ALL中,Ik6和BCR-ABL的出现显示出密切相关性(P<0.0001)。与西方人群相比较,中国儿童ALL人群中B-ALL中t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL 的发生率(14.60%)和T-ALL中HOX11 表达率(25.24%)比较高,但t(12;21)(p13;q22)/ETV6-RUNX1 的发生率(15.34%)比较低。低二倍体的发生率无论在儿童还是成人中,中国人的发生率都比西方国家低(儿童10.61% vs. 20-38%,成人2.36% vs. 6.77-12%)。除此之外,中国成人ALL人群中HOX11L2表达率明显高于西方国家(20.69% vs. 4-11%)。总而言之,中国ALL病例中不良预后因子的发生率比西方国家高。
2、中国人群初发急性淋巴细胞白血病(II):1091例病例中遗传学异常的预后相关性研究
白血病的分子遗传学异常特征不仅提示了发病机制,也为新的治疗策略提供了突破口,从而有望提高病人预后。我们分析了1091例中国人群急性淋巴细胞白血病病例的分子遗传学异常特征及其对预后的影响。无论在B还是T-ALL,随着年龄增长预后趋向不良。在儿童和成人T-ALL中,HOX11表达都是良好的预后因素。在儿童B-ALL中,我们把CRLF2高表达和IKZF1基因的Ik6缺失转录本分别鉴定为中危和高危预后因子。我们还发现,Ik6和CRLF2高表达在Ph阴性病例中具有重要的预后提示作用,从而有可能在将来酪氨酸激酶抑制剂攻克Ph阳性ALL后成为新的治疗靶点。
 
(二)慢性粒细胞白血病(CML)急变机制的研究
CML是一种起源于造血干细胞的克隆增殖性疾病,病程通常分为慢性期、加速期和急变期三个阶段。慢性期患者对于羟基脲、干扰素、温和化疗以及酪氨酸激酶抑制剂如格列卫等相关治疗的反应好,能获得完全缓解。患者一旦经加速期进入急变期,病情险恶,对各种治疗反应差,预后不佳。CML具有特征性的t(9;22)(q34;q11)染色体易位,产生BCR-ABL融合基因。已知BCR-ABL是CML慢性期的主要致病原因,但CML急变的确切分子机制目前尚不清楚。我们通过对造血系统中起关键作用候选基因的筛选发现,与造血细胞分化相关的转录因子RUNX1基因突变与CML急变患者密切相关。发现12.9%(11/85)的CML急变患者存在RUNX1突变,大部分突变都发生在Runt同源盒结构域(RHD)。此外,我们对位于不同功能域的RUNX1突变进行了功能研究,包括位于RHD的H78Q、R139G、D171G、R174Q和V91fs-ter94突变,位于转录激活结构域(TAD)的R293X突变,位于转录抑制结构域(TRD)的G381fs-ter570突变。研究发现,突变型RUNX1不仅失去了转录激活能力,另外还对野生型RUNX1蛋白具有显性负抑制作用。临床上,所有伴有RUNX1突变的CML急变患者,都发生向髓系方向急性转化的AML。与之相一致,H78Q和V91fs-ter94能阻滞由G-CSF引起的32D细胞向髓系分化。小鼠模型实验显示,RUNX1 H78Q和BCR-ABL共表达能够诱导小鼠发生CML急性期样的疾病,RUNX1 V91fs-ter94和BCR-ABL共表达的小鼠则出现CML加速期样的表型。以上结果提示RUNX1基因突变与CML急变的发病机制密切相关,可能是部分CML急变患者病程进展的主要原因。
 
(三)白血病代谢组学预后相关分子标志筛选及临床验证
最近,在IDH1/IDH2基因突变的AML患者的血清中,发现小分子代谢物2-羟基戊二酸(2-hydroxyglutarate, 2-HG)水平升高。然而,2-HG对AML患者的预后评估价值并未见报道。我们采用气相色谱质谱的方法,定量检测健康对照和造血系统肿瘤包括AML患者血清的2-HG水平。分析2-HG不同水平的AML患者的生存差异,同时,比较不同2-HG水平的患者骨髓白血病细胞的基因表达和DNA甲基化的改变情况。跟健康对照比较,在常见的造血系统肿瘤中,只有AML患者的2-HG水平显著升高。以600个健康对照的2-HG水平的均数加5倍标准差为界定值,在367个AML患者中,16.89%的患者2-HG水平高于界定值,定义为高2-HG组62例,其他定为正常2-HG组305例。高2-HG组患者,年龄比较大,AML-M0/M1的比例较高,染色体核型正常的比例较高,差异有统计学意义。在234例核型正常的AML患者中,Cox 回归的单因素和多因素分析(OS和EFS)提示2-HG升高是独立于年龄、WBC、IDH1/IDH2突变的预后差的标志物。在其他基因突变数据完整的202例核型正常的AML患者中,2-HG升高是独立于WBC、CEBPA突变预后差危险因子之一。在AML患者中,高2-HG水平与IDH1/IDH2突变密切相关(P<0.001)。与正常2-HG组比较,高水平组患者的基因表达谱和甲基化谱发生显著改变。以上结果显示2-HG可作为AML患者预后评估的标志物。
1.         Chen B, Wang YY, Shen Y et al. Newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia in China (I):abnormal genetic patterns in 1346 childhood and adult cases and their comparison with the reports from Western countries. Leukemia 2012. 26:1608-1616
2.         Mi JQ, Wang X, Yao Y et al. Newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia in China (II): prognosis related to genetic abnormalities in a series of 1091 cases. Leukemia 2012. 26:1507-1516
3.         Zhao LJ, Wang YY, Li G et al. Functional features of RUNX1 mutants in acute transformation of chronic myeloid leukemia and their contribution to inducing murine full-blown leukemia. Blood 2012; 119:2873-2882
4.         Chen SJ. Mutation associations in RA-defiant APL. Blood 2012; 120:1969-1970
5.         Chen SJ, Zhou GB. Targeted therapy: The new lease on life for acute promyelocytic leukemia, and beyond. IUBMB Life.2012;64:671-675
 
年度申请专利
申请国内发明专利1项: 《毛萼乙素在自身免疫性疾病药物中的应用》
专利号201110132949.3
 
三、造血细胞信号转导和白血病干细胞(诸江)
过去的一年,课题组主要在二个研究方向上取得进展,目前处于工作总结和发表阶段。二个课题实际上是分别从细胞学和分子生物学水平探讨白血病及成骨肉瘤诱导分化的机制及相关转化医学研究。
一是有关维甲酸诱导基因I(Retinoic acid inducible gene I, Rig-I)对正常和恶性造血调控作用及其相关信号转导途径的研究,其二为对APL白血病始动细胞( leukemia-initiating cells, LICs)及人成骨肉瘤肿瘤干细胞(tumor-initiating cells, TICs)的分离鉴定及体内分化机制研究。在Rig-I相关研究方面,课题组发现Rig-I可在无外源性RNA刺激的条件下,通过竞争性抑制Src对AKT的活化从而抑制正常和白血病粒细胞的增殖和分化。该机制相对独立于以前发现的、其对Stat1的活化作用。在LIC相关研究方面,课题组主要以转基因小鼠白血病模型为研究对象,发现APL LSC相关表面分子标志与髓系祖细胞相似,其在体内以分阶段的方式分化成熟,部分分化细胞可通过去分化的路径重建白血病。研究也鉴定出调节APL细胞分化状态的关键分子机制。在成骨肉瘤研究方面,我们发现人高危成骨肉瘤肿瘤干细胞的表面标志,及一促进其体内分化的分子通路。另外,在白血病造血微环境研究方面也取得一定进展。发表邀请综述一篇。
除上诉研究工作外,课题组还承担“流式细胞分选平台”的常规运转和对外服务工作。
年度发表论文
Huang MM, Zhu J. The regulation of normal and leukemic hematopoietic stem cells by niches. Cancer Microenviron. 2012 Dec;5(3):295-305.
四、实验血液学研究(赵维莅)
2012年课题组主要致力于恶性淋巴瘤疾病进展标志物和靶向治疗的研究。在淋巴系统恶性疾病的发生发展中,患者的遗传易感性与致癌物质暴露之间的关系密切。研究显示,解毒酶的遗传多态性是癌症风险存在个体差异的重要因素,尤其是当与其他遗传异常和基因-环境相互作用共同存在时。谷胱甘肽-S-转移酶(GST)催化谷胱甘肽(GSH)是人类解毒的主要途径之一。作为第二阶段酶的生物转化作用,GSTT催化还原型GSH与底物的亲电中心结合,后者包括反应性的内源性和活化外源性分子以及环境污染物而起到解毒的作用。谷胱甘肽S-转移酶(GSTT)家族的解毒酶基因多态性与淋巴瘤的发病率增加有关。 我们对GSTT1的遗传多态性在非霍奇金淋巴瘤患者中的发生比例及其与致癌物质的易感性的关系进行了研究。 结果显示,与对照组相比,GSTT1基因的缺失更频繁地发生于淋巴瘤患者中。GSTT1 null基因型个体淋巴瘤的发生风险显著增加。进一步的研究表明,淋巴瘤细胞转染GSTT1后更耐受多环芳香碳氢化合物诱导的DNA损伤,在异种移植的裸鼠体内肿瘤的形成侵袭性明显下降。同时,GSTT1过表达细胞中自噬显著增加。因此,GSTT1在致癌剂相关的淋巴瘤的发生中起着重要的作用。
磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)作为细胞能量状态的主要传感器,广泛参与肿瘤进展和抗肿瘤药物耐药。我们的研究表明,AMPK在恶性淋巴瘤中呈失活状态,导致下游哺乳动物雷帕霉素(mTOR)信号通路上调。我们研究了组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)和mTOR抑制剂temsirolimus在Burkitt白血病/淋巴瘤细胞和动物模型中的相互作用。丙戊酸联合temsirolimus能协同抑制Burkitt白血病/淋巴瘤细胞的增殖,显著阻滞细胞周期,诱导肿瘤自噬。同时,两者共同下调mTOR信号通路和c-MYC癌蛋白。丙戊酸通过激活AMPK通路增强Burkitt白血病/淋巴瘤细胞对temsirolimus的敏感性。运用小干扰RNA(siRNA)特异沉默AMPK能拮抗丙戊酸介导的mTOR/c-MYC下调,肿瘤细胞生长抑制和自噬诱导作用。作为一种HDACI,VPA可抑制III类HDAC SIRT1,继而激活LKB1和AMPK。特异沉默SIRT1能拮抗VPA介导的LKB1/AMPK上调和自噬性细胞死亡。另一方面,VPA可通过HDAC3的抑制作用部分对抗temsirolimus相关的AKT活化。联合应用能有效地抑制原代肿瘤细胞的生长而对正常的造血干细胞无明显影响。在Namalwa细胞小鼠异种移植模型中,丙戊酸联合temsirolimus能有效阻止肿瘤的生长,激活AMPK,下调c-MYC和诱导原位自噬。上述结果证实,mTOR和组蛋白去乙酰酶抑制剂具有协同的抗Burkitt白血病/淋巴瘤作用,拓展了两药联合在治疗c-MYC阳性淋巴细胞恶性增殖性疾病中的应用前景。通过激活AMPK选择性靶向mTOR通路诱导细胞自噬,可能是一个潜在治疗淋巴瘤的新战略。
年度发表论文
1.         Shi WY, Xiao D, Wang L, Dong LH, Yan ZX, Shen ZX, Chen SJ, Chen Y, Zhao WL. Therapeutic metformin/AMPK activation blocked lymphoma cell growth via inhibition of mTOR pathway and induction of autophagy. Cell Death Dis. 2012 Mar 1;3:e275
2.         Xu PP, Wang Y, Shen Y, Wang L, Shen ZX, Zhao WL. Prognostic factors of Chinese patients with T/NK-cell lymphoma: a single institution study of 170 patients. Med Oncol. 2012;29(3):2176-82
 
五、白血病诱导分化、凋亡机制研究(童建华)
2012年本课题组的研究工作主要围绕两个方向开展:1)髓系白血病细胞分化过程中关键基因的研究;2)cAMP/PKA信号途径在白血病细胞分化中的作用。
       Rig-G是从经维甲酸处理的急性早幼粒白血病细胞系NB4中分离得到的基因。我们在以前的工作中已经证明Rig-G具有抑制肿瘤细胞增殖和促进细胞分化的活性,它除了能够上调细胞周期抑制因子p27和p21的蛋白水平,还可以与CSN5蛋白发生相互作用,改变后者在细胞内的分布,并影响CSN5蛋白单体的功能。我们最近的研究表明,Rig-G还可以破坏COP9信号体(COP9 signalosome,CSN)复合物的的生物学功能。CSN复合物由8个亚基(CSN1-8)组成,高度保守,主要具有金属蛋白酶、去泛素化酶以及磷酸激酶三种活性,其针对SCF-E3泛素连接酶亚基的去neddylation作用和去泛素化作用在SCF-E3酶活性调控中发挥着重要功能。我们发现Rig-G蛋白可以通过破坏CSN复合物的组成,使细胞中CSN复合物的含量下降,导致SCF-E3连接酶因过度活化而发生亚基的自身降解,造成SCF-E3连接酶的稳定性和活性下降,结果使得多种重要的底物蛋白的泛素化受抑,降解受阻,在细胞内累积,最终引起细胞内多条信号通路发生紊乱。该项工作第一次揭示了Rig-G在SCF-E3连接酶活性调控中的作用,进一步阐明了Rig-G的生物学功能,同时也加深了我们对CSN复合物有可能成为肿瘤诊断和治疗的潜在靶标的理解。
       在本年度中,我们还利用可诱导Rig-G表达的细胞模型,通过蛋白质组学技术对Rig-G表达前后细胞内的蛋白表达情况进行了分析,筛选到了一些表达有显著差异的蛋白质,目前正在对其中部分蛋白做进一步的研究。组胺释放因子TCTP就是其中的一个蛋白,我们发现Rig-G可以显著下调TCTP蛋白,初步的研究显示TCTP的下降可以协同维甲酸诱导白血病细胞的凋亡。
       在cAMP/PKA信号途径方面,我们曾报道对维甲酸敏感的NB4细胞内的cAMP水平明显高于对维甲酸耐药的NB4-R1细胞。进一步的研究发现,腺苷酸环化酶(AC)的特异抑制剂能使NB4细胞内的cAMP含量下降,且阻断维甲酸对NB4细胞的诱导分化作用;而AC的激动剂则能使NB4-R1细胞内的cAMP含量明显上升,并协同ATRA诱导细胞分化,从而逆转NB4-R1细胞对维甲酸的耐药,表明AC的活化对维甲酸的诱导分化作用至关重要。相关资料显示,目前在人类中AC存在10个亚型(AC1-10)。为了进一步研究AC与APL细胞维甲酸耐药之间的关系,最近我们对NB4和NB4-R1两种细胞中的部分AC亚型进行了检测。结果发现,NB4-R1细胞中AC9蛋白表达明显低于NB4细胞,目前我们正在对腺苷酸环化酶在APL细胞分化中的重要作用及其对APL细胞维甲酸耐药性的影响进行深入的研究。
 
六、血友病基因治疗和白血病免疫治疗基础研究(奚晓东)
血栓与止血研究课题组现有两个主要的研究方向即一、血栓与止血过程相关的信号转导和调控机制的研究;二、凝血因子及遗传性出血病和血栓病的研究。这两个主要研究方向在2012年中均获得了实质性的进展。
血栓与止血过程相关的信号转导和调控机制研究方向目前有三项国家自然科学基金课题即“整合素αvβ3/Src激酶相互作用的分子机制及其病理生理意义”(81070414)、“APL细胞中PML/RARα融合蛋白调控组织因子转录的分子机制研究”(81100367)和“RGT肽及相关分子调控血小板功能的分子机制研究”(81270594)以及一项973项目子课题即“重大心血管疾病相关GPCR新药物靶点的基础研究”(2012CB518001)在研。
在整合素αIIbβ3双向信号转导及分子机制研究方面,我们详细分析了RGT肽在整合素外向内信号转导中的作用及其分子机制,同时对其作为抗血栓新策略的应用前景进行了评估。RGT肽的作用不依赖于膜锚定且不影响c-Src的活性,但能抑制整合素αIIbβ3外向内信号转导参与的Src活化;在高剪切力下对血小板聚集的抑制较在低剪切力下更明显。活化的c-Src能直接磷酸化β3尾部747位和759位酪氨酸并且并不依赖于其与β3末端RGT序列的结合,而是其激酶活性的活化依赖于这种结合。β3缺陷小鼠转基因的实验条件已基本优化并已建立整合素β3的Δ759、Δ754和ΔNITY突变体转基因模型。在功能研究中,带Δ759、Δ754突变体的小鼠血小板在固相化纤维蛋白原上的伸展受损;Δ759突变结合可溶性纤维蛋白原的能力正常而且在1500 s-1剪切力下维持一定的形成血小板聚集块的能力,而Δ754突变则表现为前者缺失及后者严重受损。
凝血因子及遗传性出血病和血栓病研究方向目前有四项国家级科研项目在研,着重于凝血因子结构与功能的关系,分别是国家自然科学基金资助的“凝血因子VIII Trp1707Ser突变相关抑制物的作用机制研究”(81000206)、“AAV介导的八因子抑制物免疫耐受诱导研究”(81000205)和“凝血因子FVIII Trp1707Ser突变导致抑制物产生的细胞免疫机制研究”(81170480)以及973项目子课题“iPS技术结合基因治疗的方法,以血友病甲为模型探讨遗传性疾病的再生医学治疗模式”(2013CB966804)。
今年共对 120个血友病A家系和48个血友病B家系的相关女性成员进行了血友病携带者和产前诊断。遗传性出血病方面,对六种共45个少见的遗传性凝血因子缺陷症家系、3个血小板无力症家系、1个遗传性出血性毛细血管扩张症家系、8个VWD家系进行了相关基因与功能的研究。遗传性血栓病方面,对9个AT缺陷家系、10个PC缺陷家系和1个蛋白S家系进行了相关基因诊断与功能的研究。其中,对1例低异常纤维蛋白原血症研究发现来自母亲4号染色体单亲二倍体及纤维蛋白原Bβ链 Trp323X杂合突变是其致病机制;在10例重型血友病A患者中发现了10中大缺失,并明确其断裂点,分析可能的重组机制。分析了1种F10基因剪接位点突变(IVS5+1G>A)异常剪接机制及1种错义突变(Asp409del mutation)并分析了该突变导致功能缺陷但表达正常。引进了FVIII基因敲除小鼠作为血友病A小鼠模型病鉴定其FVIII活性小于1%;构建了αIIb启动子控制的FVIII基因表达载体并开始了将血友病A小鼠尾尖成纤维细胞诱导成为iPS细胞的实验。
2012年共完成SCI论文6篇、国内核心期刊论文4篇,毕业博士研究生2名、硕士研究生4名。目前在读研究生14名(含博士研究生2名)。
年度发表论文
1.         Zhou JW, Liang Q, Chen Q, Xie Y, Ding QL, Wang XF, Xi XD, Wang HL: Molecular defects in the factor X gene caused by novel heterozygous mutations IVS5+1G>A and Asp409del. Haemophilia. 2012 Aug 29. doi: 10.1111/j.1365-2516.2012.02933.x.
2.         Ding QL, Lu YL, Dai J, Xi XD, Wang XF, Wang HL: Characterisation and validation of a novel panel of the six short tandem repeats for genetic counselling in Chinese haemophilia A pedigrees. Haemophilia. 2012;18(4):621-5.
3.         Xia Y, Lu QY, Lu YL, Dai J, Ding QL, Wang XF, Xi XD, Wang HL: Molecular basis of type I antithrombin deficiency in two women with recurrent venous thromboembolism in the first trimester of pregnancy. Blood Cells Mol Dis. 2012;48(4):254-9.
4.         Dai J, Lu Y, Ding Q, Wang H, Xi X, Wang X: The status of carrier and prenatal diagnosis of haemophilia in China. Haemophilia. 2012;18(2):235-40.
5.         姜林林,王学锋,丁秋兰,许冠群,张利伟,戴菁,陆晔玲,奚晓东 王鸿利。四例遗传性异常纤维蛋白原血症患者基因型和凝血功能分析。中华血液学杂志.2012;31(6): 475-479.
6.         姜林林,王学锋,丁秋兰,许冠群,张利伟,戴菁,陆晔玲,王鸿利,奚晓东。两个3型遗传性血管性血友病家系表型和基因型分析。中华医学遗传学杂志. 2012;29(5):524-528.
 
七、造血干细胞发育和表观遗传学
1. 磷脂酶C在斑马鱼原始粒细胞的成熟过程中起重要作用
斑马鱼的造血调控包括造血干细胞的形成及各系分化与哺乳动物高度保守。在斑马鱼中,原始粒细胞起源于两个不同的位点,一个是斑马鱼前部侧板中胚层,另一个是ICM区。目前在斑马鱼中对粒细胞的研究还很少。本项研究中,我们通过ENU化学诱变的前向遗传学筛选得到一个粒系特异基因mpx表达显著降低,而其它各系造血基本正常的斑马鱼突变株。定位克隆实验揭示突变累及基因为磷脂酶C,其功能缺失特异影响粒细胞发育,尤其是粒细胞的成熟过程。我们的结果第一次发现磷脂酶C在斑马鱼ICM区粒细胞生成过程中发挥重要作用,提示斑马鱼造血各系分化具特异的调控通路。
 
2. 大麻碱II型受体CB2通过调控JNK/c-Jun/5-磷脂酶通路抑制斑马鱼白细胞的炎性迁移
免疫细胞炎性迁移参与了许多人类免疫相关疾病的进展过程,因此寻找抑制免疫细胞炎性迁移的小分子药物以及研究其调控机制对于免疫相关疾病的治疗具有重要意义。大麻碱II型受体CB2对于免疫细胞迁移的调控作用已被广泛研究,但其调控机制尚不明确。我们利用一个活体斑马鱼炎性细胞迁移模型进行了一次大规模的小分子化合物筛选,从中筛选得到大麻碱受体激动剂与5-磷脂酶(5-LO)抑制剂均能有效抑制斑马鱼白细胞的炎性迁移,并且筛选得到的小分子均能有效抑制人THP-1细胞系的体外趋化性迁移。CB2突变的斑马鱼胚胎中白细胞的炎性迁移显著增加,而敲低5-LO表达后巨噬细胞的炎性迁移被明显抑制。进一步的机制研究结果表明,CB2与5-LO具有通路上的相关性,并且5-LO基因的转录直接受c-Jun调控。CB2受体受其激动剂激动后抑制JNK/c-Jun 的活性从而抑制5-LO基因的表达。因此我们的研究结果表明CB2通过JNK通路调控5-LO基因的表达,从而调控白细胞的炎性迁移。而CB2激动剂与5-LO抑制剂合用时抗炎的协同作用对于临床上治疗免疫相关疾病具有一定的指导意义。
年度发表论文
Jing CB, Chen Y, Dong M, Peng XL, Jia XE, Gao L, Ma K, Deng M, Liu TX, Zon LI, Zhu J, Zhou Y, Zhou Y. Phospholipase C gamma-1 is required for granulocyte maturation in zebrafish. Dev Biol. 2012 Dec 7. Epub ahead of print
 
八、基因芯片的研制、应用和开发(张济、王侃侃)
新兴的高通量组学方法为全面、准确地揭示疾病的机制提供了全新理念与技术保障。本课题组主要采用ChIP-seq和RNA-seq等高通量组学技术结合自主开发的生物信息学分析方法对白血病发生和治疗的复杂性与多样性展开研究。
首先,利用ChIP-Seq技术以急性早幼粒细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)为模型,研究各种不同的表观遗传修饰在APL发生中的特点。通过深层次分析测序片段蕴涵的生物学意义,探讨白血病发生过程及ATRA诱导分化过程中异常的表观调控机制。我们选取了多种与转录激活和抑制密切相关的组蛋白抗体及共激活或抑制因子抗体,在APL细胞加ATRA处理前后进行全基因组水平的组蛋白修饰状态ChIP-Seq分析,以期在确定表观遗传修饰位点与转录激活和抑制因子的位点的关系,揭示它们对转录的协同或者抑制效应。结果发现,一方面PML-RARα会引起异常表观修饰,另一方面两者共同调控基因的表达,从而在致病中发挥作用。目前这部分研究相关的manuscript正在整理中。基于高通量ChIP-seq技术平台的前期研究,我们发现APL累及的融合蛋白PML-RARα选择性抑制造血特异性转录因子PU.1及其相关通路。为进一步揭示受累造血转录因子PU.1在APL发病发展过程中所起的作用,我们以临床样本为研究对象,对比APL病人细胞和造血正常细胞中PU.1的表达量,发现PU.1的表达在APL病人样本中,尤其是在APL起始细胞中,被PML-RARα特异性地抑制。这一结果说明PU.1的低表达在APL起始阶段中起了关键性的作用。该研究成果发表在2012年Journal of Hematology & Oncology杂志。
同时本课题组通过高通量组学技术获得了大量白血病发生累及的融合蛋白PML-RARα和AML1-ETO的靶基因。在此基础上我们进一步深入的研究了关键靶基因的转录调控机制。作为PML/RARα靶基因之一的HCK是造血细胞特异性表达的Src酪氨酸激酶家族成员之一,其表达水平在APL中被PML/RARα显著抑制。通过深入研究HCK基因的转录调控机制,发现PML/RARα通过抑制PU.1对HCK启动子的激活而发挥作用,并精确定位了多重PU.1位点对其转录活性的必须性。酪氨酸激酶一般具有癌基因的特征,然而此研究揭示了HCK是一个具有肿瘤抑制活性的的酪氨酸激酶基因。该研究成果发表在2012年Leukemia Research杂志上。通过对t(8;21)染色体易位的急性髓系白血病样本的高通量数据分析,发现AML1-ETO表达的病人样本中CTSG整体表达水平较AML1-ETO阴性的病人样本低,分子生物学实验进一步证实AML1-ETO通过结合在CTSG的启动子区特异性抑制其转录活性,降低CTSG mRNA水平和蛋白质水平的表达,同时CTSG又可以在体内和体外对AML1-ETO进行酶切促其降解。这一研究成果发表在2012年Oncogene杂志上。
我们不仅应用高通量组学平台研究白血病的转录调控机制研究,还开展了其他重大疾病的相关研究。结核病在中国流行广泛,尤其近几年耐药结核菌呈上升趋势,迫切需要更加深入研究宿主对结核杆菌的应答机制。因此我们利用全基因组表达谱分析平台,选择不同W-Beijing菌株(包括H37Rv)感染THP-1细胞,从转录组层面分析宿主对W-Beijing菌株的应答。结果显示宿主对不同菌株的应答较相似,主要以上调基因为主(THP1r2Mtb-induced基因集)。其中发现该基因集和活动性肺结核相关的干扰素诱导基因集明正显相关,和活动性肺结核的治疗进程负相关,并且该基因集具有结核病特异性。该研究成果发表在2012年PLoS One杂志上。
年度发表论文
1.         Jin W, Wu K, Li Y, Yang W, Zou B, Zhang F, Zhang J and Wang K. AML1-ETO targets and suppresses cathepsin G, a serine protease, which is able to degrade AML1-ETO in t(8;21) acute myeloid leukemia. Oncogene 2012 May 28. doi: 10.1038/onc.2012.204.
2.         Wu K, Dong D, Fang H, Levillain F, Jin W, Mei J, Gicquel B, Du Y, Wang K, Gao Q, Neyolles O, Zhang J. An interferon-related signature in the transcriptional core response of human macrophages to Mycobacterium tuberculosis infection. PLoS One 2012, 7(6):e38367.
3.         Zhu X, Zhang H, Qian M, Zhao X, Yang W, Wang P, Zhang J and Wang K. The significance of low PU.1 expression in patients with acute promyelocytic leukemia. Journal of Hematology & Oncology 2012, 5:22
4.         Zou D, Yang X, Wang P, Zhu X, Yang W, Jia X, Zhang J and Wang K. Regulation of the hematopoietic cell kinase gene by PML/RARα and PU.1 in acute promyelocytic leukemia. Leukemia Res. 2012, 36:219-223.
 
九、感染性疾病和血液病相关基因的结构生物学研究(蒙国宇)
本课题组基本完成了结构生物学实验室和平台的第一阶段(即立足阶段)的建设,取得的标志成就包括:1)充分利用现有的设备和技术,我们基本能完成从基因到蛋白结构的解析;2)建立了包括中(包括上海光源)、英、美、欧洲的国际合作团队,利用多领域和多学科的交叉融合,对流行性疾病(特别是在革兰氏阴性菌的毒性蛋白分泌系统和病原菌与宿主结合机理方面)和血液病病理进行系统、细致的研究;3)目前,我们已取得了一些标志性的结果,即解析了新的晶体结构(相关成果已发表在Blood)。除此之外,我们在逐步完善新技术和新平台的建设中,也创建了合理的管理制度来充分合理使用现有平台,为未来结构生物学在国家基因组学重点实验室进一步发展提供了一个良好的环境。在人员培训方面,我们的研究团队组成合理,包括研究员,副研究员,博士后和在读博士生,经过近一年的科研培训,对蛋白表达、制备、纯化、结晶和结构解析等方面,在理论和实践上都形成了较深刻的认识,在试验水平上形成了“老带青,青激发老”的喜人局面,为今后的第二阶段(即发展阶段)提供了结实的人才基础。
本课题组的主要在研的项目有:
(一)流感嗜血杆菌的发病机制
通过研究流感嗜血杆菌整合素的作用机制,从结构生物学的水平阐述流感嗜血杆菌与人类宿主细胞结合的机理,从而为日后研发针对该类细菌的新型的低抗药性的小分子化合物药物提供生物学的依据。
(二)革兰氏阴性菌自转子分泌系统
据已知数据,大约有700多个革兰氏阴性菌毒素都通过该分泌系统分泌到细菌体表从而赋予细菌吸附于宿主并逃避宿主免疫系统吞噬的能力。对该分泌系统的结构分析,能为日后研发针对该类细菌的低抗药性的抗感染药物提供生物学的依据。
(三)革兰氏阴性菌协助外膜蛋白的插膜系统
该跨膜蛋白聚合物系统,是外膜合成的重要组成部分,抑制该系统将能有效抑制革兰氏阴性菌的生长。因此,对该聚合物的理解,将有助于研发针对革兰氏阴性菌病原体的高效抗生素。
(四)依托国家重点实验室,与其他研究组充分合作
主要开展两方面的研究:一是解析实验室发现的与疾病相关的新基因,例如手足口病病毒EV71的病毒壳蛋白与人类受体蛋白等结构复合物的解析;二是解析与白血病相关的蛋白结构,如PML-RARa与砷的结合、AML-ETO, NUP98-IQCG, RIG-G, RIG-I, RIG-K等与血液病密切相关的新基因,为了进一步阐述白血病发病原理和开展小分子药物(Structure-based drug design)的研发提供结构生物学的基础。
 
年度发表论文
Xiao R, Xi X, Chen Z, Chen SJ, Meng GY. Structural framework of c-Src activation by integrin b3.November 20,2012;doi:10.1182/Blood-2012-07-440644.
 
十、肿瘤靶向治疗研究(任瑞宝)
干扰素调节因子4(IRF4)最初被发现为癌蛋白,对多发性骨髓瘤癌细胞生存的维系起重要作用。近来,我们首次发现IRF4 在早期B-淋巴细胞及髓细胞中的功能为癌抑制蛋白。我们的研究发现IRF4的抑癌作用不依赖它的DNA结合功能。这一发现对发展多发性骨髓癌及白血病的治疗具有重要指导作用。
RAS异常激活与恶性肿瘤的发生发展密切相关。30%人类恶性肿瘤存在RAS基因突变,另有许多调节RAS活性的相关基因发生致癌性突变也能引起RAS的异常激活。但是,由于RAS的酶活性起“自我关闭”作用,且突变后因RAS鸟苷酸酶失活而将RAS锁在与GTP结合的激活状态,导致RAS蛋白本身无法成为抗肿瘤治疗的理想“靶点”。 RAS突变引起的肿瘤被列为最难攻克的癌症之一,寻找其他可能阻抑RAS信号通路的靶点对于RAS相关肿瘤的治疗至关重要。我们利用NRAS诱导的白血病动物模型检验了蛋白质翻译后修饰在RAS致白血病过程中的重要性。我们发现棕榈酰化在致癌性NRAS诱发的白血病产生过程中至关重要。这一工作显示靶向棕榈酰化修饰的治疗可能对包括恶性血液肿瘤在内的RAS相关肿瘤产生很好的治疗效果。
蛋白质棕榈酰化是一种可逆的脂修饰,迄今为止,哺乳动物中已发现至少24种棕榈酰转移酶。我通过基因敲除的方法揭示RAS具有一种以上棕榈酰转移酶。我们在继续研究其他棕榈酰转移酶的正常生理功能及其在RAS恶性转化过程中所起的作用。同时,为研发抗RAS棕榈酰化修饰靶向治疗,我们已成功建立RAS靶向细胞毒性的药物筛选方法,设计并合成了一系列抑制蛋白质脂修饰的定向小分子化合物,初步筛选并发现了能够选择性杀伤RAS转化细胞的一批具有不同化学核心结构的新小分子化合物。我们将进一步研究针对蛋白质棕榈酰化修饰的小分子化合物探针,为深入认识RAS棕榈酰化的生物学过程提供重要的研究工具,为重大疾病的诊断和防治提供新的标记物、新的药物作用靶点和新的先导结构,从而为创新药物的发现奠定基础。
 
十一、内分泌免疫和感染性疾病基因组学研究(宋怀东)
为了进一步深入探讨甲亢的遗传学发病机制,我们在总共9,529甲亢病人和9,984正常对照的中国汉族人群中进行了一个三阶段全基因组关联分析研究。结果显示:我们识别和验证了5个新的甲亢易感位点,包括染色体X q21.1的GPR174-ITM2A22q12.3-13.1的C1QTNF6-RAC21q23.2的SLAMF69q34.2的ABO,和一个位于14q32.2区段的包含有两个非编码RNA的基因间区域。同时该研究还验证了一个以前不确定的甲亢易感区段,即位于8q24.22的TG。这六个区段的易感单核苷酸多态性(SNP)均达到了全基因组关联分析的水平,即Pcombined < 5×10-8。表达分析实验结果显示:染色体Xq21.1和14q32.2区段内相应的甲亢易感SNP位点的基因型分别和该区段相应的易感基因ITM2A和C14orf64表达相关,且以前的实验研究和我们的研究均显示ITM2A参与了逃避X染色体失活。接下来,我们对于甲亢的候选位点进行了在男性和女性的关联性的异质性分析。异质性分析结果显示:染色体Xq21.1的rs5912838 位点和染色体22q13.1的rs2284038 位点显示了男性和女性和甲亢关联性的差异。该研究使目前的甲亢确定的易感位点由九个增加到了至少十五个,且提示非编码RNA在甲亢的发病中起一定的作用。男女性和甲亢关联系的异质性分析结果揭示了甲亢在女性多发的潜在机制。