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血研所2011年度各课题组进展情况
发布日期:2011-12-30 浏览次数:307

一、白血病系统生物学(陈竺)
全外显子组测序发现急性单核细胞白血病的高频体细胞突变基因DNMT3A
表观遗传学异常被认为是引起癌变的发病机制之一。我们应用第二代测序技术,对9对含有正常对照组织的急性单核细胞白血病(AML-M5)样本进行了全外显子组测序,检测出一批与M5型白血病致病相关的体细胞突变基因。其中,编码DNA甲基转移酶3A蛋白的DNMT3A基因在AML-M5中的突变频率达20.5%(23/112)。体外实验证实,DNMT3A突变体均显示低酶活或者高组蛋白H3结合力的改变。有意思的是,通过甲基化谱芯片和表达谱芯片的筛查,发现某些重要基因,如HOXB家族基因簇,在DNMT3A突变的样本中显现一致性的低甲基化水平和高表达转录本。结合临床资料,含DNMT3A突变的M5患者与MLL突变患者相比较,骨髓象中以偏成熟的病变单核细胞为主(p=0.016)。在年龄分布上,DNMT3A突变的患者相对年长(p=0.001),在预后方面,DNMT3A突变的M5患者明显比无该突变的总生存期短(p=0.004),治疗失败时间也短(p=0.005)。另外,DNMT3A基因的突变热点R882位点异常在AML-M4样本中的发生频率也达13.6%。总之,高频突变基因DNMT3A为今后单核系白血病的分子诊断和临床治疗提供了又一新的标志物。

年度发表论文

Yan XJ, Xu J, Gu ZH, et al. Exome sequencing identifies somatic mutations of DNA methyltransferase gene DNMT3A in acute monocytic leukemia. Nat Genet. 2011;43:309-315.
 
二、白血病发病原理研究(陈赛娟)
(一)1185例急性髓细胞白血病基因突变表现及预后意义
为了评估基因突变在急性髓细胞白血病中的预后评判价值,我们在1185例AML中检测了AML1 (CBFα)–ETO, CBFβ-MYH11, PML-RARα, 和MLL融合基因,以及一系列基因突变,包括FLT3, C-KIT, N-RAS, NPM1, CEBPA, WT1, ASXL1, DNMT3A, MLL, IDH1, IDH2, 和 TET2。临床分析主要在605例核型正常的患者(除了11q23)中进行。在这605例患者中,452例(74.7%)至少有一个上述突变,我们对这些基因突变和临床预后进行了分析。我们发现,无论是在整组患者还是年轻患者中,NPM1, DNMT3A, FLT3, IDH1, IDH2, CEBPA和TET2突变之间存在相关性。多因素分析发现DNMT3A和MLL突变是独立的预后不良的标志,而双等位基因CEBPA突变和NPM1突变但无DNMT3A突变提示预后较好。应用这些分子标志,可使我们将605例患者分成具有不同意义的预后组。
 
(二)急性髓系白血病中DNA修复基因的遗传变异及其预后意义
多数人类白血病,包括急性髓系白血病(AML)具有染色体基因组不稳定的特征,如:染色体易位、缺失、倒位等,与白血病的发生、分类、治疗和预后有密切的联系。DNA双链的断裂和不正确修复是导致DNA重组和变异的原因之一,而DNA修复功能的异常可以使肿瘤细胞对抗癌药物产生耐药性,最终影响化疗疗效。我们的研究综合文献报道和SNP数据库信息,针对DNA修复途径中15个重要基因的42个变异位点,在307例AML和560例正常对照中利用MassARRAY质谱检测系统进行基因型分析,发现XPD 2251C等位基因频率在AML患者中显著高于正常对照组。而AML患者预后分析结果显示,ATM 4138CT杂合子和TP53 215GG纯合子无论在患者的完全缓解率还是总体生存期方面都提示了不利预后。已有文献报道,这两个DNA修复相关基因的变异位点具有重要的生物学功能。我们的研究结合了DNA修复相关基因的变异分析和病史资料整理,通过较为系统的筛查,为临床AML患者的诊断治疗增添了新的预测分子。并且,根据DNA修复能力的差异选取药物以降低肿瘤细胞的多药耐药性也将为肿瘤耐药的逆转提供新的思路。
 
(三)C-KIT与AML1-ETO共同作用导致小鼠发生急性髓性白血病
t(8;21)(q22;q22)是人类急性髓性白血病(AML)中最常见的特征性染色体易位之一,该易位可导致AML1-ETO融合基因的产生。在以往的动物模型研究中发现,全长的AML1-ETO单独作用不足以引起白血病的发生,提示还需要额外的突变共同作用参与白血病的发病。我们和其他研究小组发现在接近半数的t(8;21)AML 患者中存在着C-KIT突变。为证实“突变C-KIT的持续激活和AML1-ETO融合基因共同作用可以导致AML的发生”这一假设,我们应用骨髓转导和移植技术建立了共表达C-KIT突变和AML1-ETO的小鼠模型。为克服人类C-KIT在小鼠细胞中的运输阻滞问题,我们将小鼠c-Kit的胞外及跨膜区与人类C-KIT的胞内信号功能域融合,构建成新的杂合C-KIT (HyC-KIT)。研究显示,位于酪氨酸激酶区的突变HyC-KIT N822K和 HyC-KIT D816V,以及位于胞内近膜区的突变HyC-KIT 571+14和HyC-KIT 557-558Del,均可使对IL-3生长依赖的小鼠髓系前体细胞32D获得不依赖于细胞因子的生长增殖优势。蛋白酪氨酸激酶抑制剂“达沙替尼”(Dasatinib),能在低纳摩尔的水平发挥抑制表达上述C-KIT突变的32D细胞的增殖。HyC-KIT N822K能诱导小鼠发生骨髓增殖性疾病(MPD),而HyC-KIT 571+14既可引起MPD,又可导致淋巴细胞性白血病的发生。有意思的是,AML1-ETO和HyC-KIT N822K共同作用可使小鼠产生致死性的AML。因此,我们的研究进一步丰富了“二次打击模型”,即AML的发病需要转录因子和膜/细胞信号分子异常的共同作用。
(四)从古老中药到抗癌灵药:砒霜治疗白血病的分子机制
从18世纪到20世纪中期,古老的中药砒霜一直用于恶性肿瘤的治疗。在过去30年中,砒霜重新应用于白血病的治疗,它与全反式维甲酸和化疗联用能彻底缓解t(15;17)染色体易位导致的急性早幼粒白血病,这种染色体易位产生急性早幼粒白血病-维甲酸受体α(PML-RARα)融合蛋白。而砒霜可以结合巯基氨基酸并导致活性氧的产生,并影响多种信号通路。在砒霜治疗急性早幼粒白血病机制的研究中发现,砒霜直接结合PML和PML-RARα的RBCC结构域的C3HC4锌指基序,诱导同源二聚体和多聚体的形成,增强其与SUMO E2连接酶Ubc9的结合,促进后续的SUMO化/泛素化以及蛋白酶体降解。砒霜导致PML分子内二硫化物的形成,这对PML的多聚化也有促进作用。全反式维甲酸靶向PML-RARα,使其RARα部分降解,它与砒霜协同应用可以消除白血病干细胞。砒霜也可以干扰其他血液系统肿瘤相关的多种蛋白质,包括慢性粒细胞性白血病和成人T细胞白血病淋巴瘤,因此可以为这些疾病提供新的治疗策略。砒霜在急性早幼粒白血病中的成功应用及其作用机制的研究,为传统医药的振兴与发展提供了一个新的范例。

年度发表论文

1.        Shen Y, Zhu YM, Fan X, et al. Gene mutation patterns and their prognostic impact in a cohort of 1185 patients with acute myeloid leukemia. Blood. 2011;118:5593-5603.
2.        Shi JY, Ren ZH, Jiao B, et al. Genetic variations of DNA repair genes and their prognostic significance in patients with acute myeloid leukemia. Int J Cancer. 2011;128:233-238.
3.        Wang YY, Zhao LJ, Wu CF, et al. C-KIT mutation cooperates with full-length AML1-ETO to induce acute myeloid leukemia in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108:2450-2455.
4.        Chen SJ, Zhou GB, Zhang XW, Mao JH, de The H, Chen Z. From an old remedy to a magic bullet: molecular mechanisms underlying the therapeutic effects of arsenic in fighting leukemia. Blood. 2011;117:6425-6437.
 
三、造血细胞信号转导和白血病干细胞(诸江)
造血细胞信号转导和干细胞生物学课题组2011年度主要在下列二个方向取得研究进展:
(一)目前大量的分子生物学研究表明维甲酸诱导基因I(RIG-I)是识别外源性病毒RNA并启动先天性免疫的重要分子,其地位与TLR相当。基于白血病细胞RIG-I Tet诱导表达系统和Rig-I基因剔除模型,发现RIG-I在无外源性RNA存在的情况下,可与活化的Src激酶结合并抑制其对AKT和mTOR通路的调节。该调节路径与先天性免疫的RIG-I-IPS1-IRF3/Nfkb路径无关。此结合和抑制反应由RIG-I N端的CARD基团及一存在于其下游的PxxP结构域所介导。进一步的研究提示这一调节过程参与了对维甲酸、IFN及生长因子对正常及恶性髓细胞的AKT活性及细胞增殖的调控。并且,在一部分AML新鲜标本中,AKT的异常活化与RIG-I的低表达相关。这些结果表明在白血病细胞中,RIG-I是一Src-AKT途径的重要调控者。
(二)APL LIC的研究:急性早幼粒白血病(APL)是研究肿瘤诱导分化的一重要模型。近期法国学者的工作提示维甲酸可能不能靶向APL白血病起始细胞(APL LIC)并诱导其分化。美国学者的研究工作提示APL LIC富含于早幼粒样的细胞群体中。 基于对小鼠APL模型的分析,发现APL LIC不但存在于早幼粒样的细胞群体,也见于部分分化的(PD)中幼粒样细胞群体。在维甲酸处理小鼠APL模型后, 后者在体内大量扩增,可能为疾病复发的机制之一。另外,中幼粒样APL LIC在体内的自发终末分化不依赖于PML-RARα的降解机制,而是与介导其向单核细胞终末分化有关。

年度发表论文

Jiang LJ, Zhang NN, Ding F, Li XY, Chen L, Zhang HX, Zhang W, Chen SJ, Wang ZG, Li JM, Chen Z, Zhu J. RIG-I induction augments STAT1 activation to inhibit leukemia cell proliferation. Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108:1897-1902.
 
四、实验血液学研究(赵维莅)
2011年课题组主要致力于恶性淋巴瘤靶向治疗的临床前研究。磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)作为细胞能量状态的主要传感器,广泛参与肿瘤进展和抗肿瘤药物耐药。我们的研究表明,AMPK在恶性淋巴瘤中呈失活状态,导致下游哺乳动物雷帕霉素(mTOR)信号通路上调。在体外,AMPK活化剂二甲双胍能显著抑制B-和T-淋巴瘤细胞的生长,抑制mTOR通路,而且不会引起AKT的反馈激活。此外,二甲双胍联合治疗使淋巴瘤细胞对mTOR抑制剂temsirolimus和化疗药物阿霉素的反应显着增强。特异的抗-AMPK -a1的siRNA能削弱二甲双胍对mTOR通路的抑制,使抗肿瘤药物致敏。同时,二甲双胍对原代淋巴瘤细胞也有显著的抑制作用,但并不影响正常造血细胞的生长。在体内,二甲双胍诱导AMPK激活,下调mTOR通路,明显抑制淋巴瘤皮下移植瘤的生长。值得注意的是,二甲双胍口服同样有效。口服二甲双胍与阿霉素联合治疗比两种药物单独使用更有效,并能显著增加肿瘤细胞自噬。总之,这些数据提供了二甲双胍对淋巴瘤的抑制和化疗增敏效应的第一个证据。通过激活AMPK选择性靶向mTOR通路,可能是一个潜在治疗淋巴瘤的新战略。另一方面,我们研究了组蛋白去乙酰化酶抑制剂和mTOR抑制剂temsirolimus在B-淋巴瘤细胞中的相互作用。丙戊酸和temsirolimus能协同抑制B-淋巴瘤细胞的增殖,显著阻滞细胞周期,诱导肿瘤自噬。丙戊酸通过激活AMPK通路增强B-淋巴瘤细胞对temsirolimus的敏感性。两者联合应用能有效地抑制原代B淋巴瘤细胞的生长和阻止Nalmawa细胞小鼠异种移植模型肿瘤的生长。上述结果证实,mTOR和组蛋白去乙酰酶抑制剂具有协同的抗肿瘤作用,拓展了两药联合在治疗B细胞淋巴瘤中的应用前景。

年度发表论文:

Wang L, Shi WY, Yang F, Tang W, Gapihan G, Varna M, Shen ZX, Chen SJ, Leboeuf C, Janin A, Zhao WL. Bevacizumab potentiates chemotherapeutic effect on T-leukemia/lymphoma cells by direct action on tumor endothelial cells. Haematologica. 2011; 96: 927-31.
 
五、白血病诱导分化、凋亡机制研究(童建华)
    2011年度,本课题组在原有工作的基础上,从如下两方面对维甲酸诱导基因RIG-G的表达调控和生物学功能进行了深入研究。
       (一)我们发现虽然RIG-G基因的表达不必依赖经典的JAK-STAT途径,但是后者的激活能明显增强STAT2/IRF-9复合物或IRF-1对RIG-G的诱导表达作用。这一结果目前已发表在Exp Cell Res上,对于进一步阐明干扰素和维甲酸的信号转导途径,深入理解RIG-G基因表达调控的分子机制具有重要意义。
       (二)我们对RIG-G在SCF-E3泛素连接酶活性调控中的作用及其机制展开了研究,发现RIG-G可以通过与COP9信号体(COP9 signalosome,CSN)复合物中的CSN5亚基相互作用,破坏CSN复合物的组成,并影响其生物学功能。由于CSN复合物在SCF-E3连接酶的Deneddylation过程中起着重要的调控作用,它与SCF-E3酶所识别的底物靶蛋白的降解密切相关,可在胚胎发育、细胞周期调控、血管生成以及维持微环境稳态等多种生命活动中发挥重要作用。我们的研究显示,RIG-G可以使SCF-E3连接酶复合物中的部分亚基cullin1、b-TrCP等的蛋白水平明显下降,从而使SCF-E3连接酶的稳定性下降,导致底物蛋白如IkBa的泛素化受抑,降解受阻。IkBa在细胞内的累积,会直接影响NF-kB信号通路的激活,进而抑制细胞增殖。此外,RIG-G还可影响CSN复合物的蛋白激酶活性,下调c-Jun蛋白的磷酸化水平。本研究对于全面理解 RIG-G抑制肿瘤细胞增殖的作用机制具有重要意义。

年度发表论文:

1.        Lou YJ, Zhang ZL, Pan XR, Xu GP, Jia PM, Li D, Tong JH. Intact JAK-STAT signaling pathway is a prerequisite for STAT1 to reinforce the expression of RIG-G gene. Experimental Cell Research, 2011, 317, 513-520.
2.        楼叶江、潘晓蓉、许桂平、庄立琨、贾培敏、童建华。自分泌干扰素a在全反式维甲酸诱导RIG-G基因表达中的作用。中华医学杂志,in press
 
六、血友病基因治疗和白血病免疫治疗基础研究(奚晓东)
血栓与止血研究课题组现有两个主要的研究方向即一、血栓与止血过程相关的信号转导和调控机制的研究;二、凝血因子及遗传性出血病和血栓病的研究。这两个主要研究方向在2011年中均获得了实质性的进展。
在整合素αIIbβ3双向信号转导及分子机制研究方面,我们证明了RGT肽抑制整合素的外向内信号转导并不依赖于膜锚定,并且不影响c-Src的活性,活化的c-Src能直接磷酸化β3尾部747位和759位酪氨酸。利用微流体流动小室(Bioflux),我们发现在10000S-1的剪切率下洗涤的人或鼠血小板可以粘附到固相化的纤维蛋白原管道表面,而整合素β3敲除的小鼠血小板却不能粘附。在整合素αvβ3/Src激酶相互作用的分子机制的研究方面,利用已建立的各种αvβ3突变型受体的CHO细胞模型并通过可透细胞膜的RGT肽处理细胞发现在与αv复合模式下整合素β3胞内段在肿瘤细胞粘附伸展以及迁移方面发挥重要作用。β3缺陷小鼠的繁殖已初具规模,小鼠转基因的预实验已基本优化和确定了实验条件并已建立两个突变体转基因模型。在PML/RARα融合蛋白与组织因子启动子的相互作用及其分子机制的研究方面,利用含有PML/RARα融合蛋白相互作用位点的组织因子启动子序列的双链DNA“诱饵”,在NB4白血病细胞中验证PML/RARα融合蛋白对组织因子表达的调控机制,确定其能够抑制融合蛋白诱导的组织因子高表达。
今年共对 104个血友病A家系和26个血友病B家系的相关女性成员进行了血友病携带者和产前诊断。遗传性出血病方面,对六种共33个少见的遗传性凝血因子缺陷症家系、3个血小板无力症家系、1个遗传性出血性毛细血管扩张症家系、10个VWD家系进行了相关基因与功能的研究。遗传性血栓病方面,对6个AT缺陷家系、3个PC缺陷家系和3个高同型半胱氨酸血症家系进行了相关基因诊断与功能的研究。
2010年共完成国内核心期刊论文9篇,毕业硕士研究生6名。目前在读研究生16名(含博士研究生3名)。

年度发表论文:

1.        欧阳琦,丁秋兰,黄丹丹,许冠群,张利伟,戴菁,陆晔玲,王学锋,奚晓东,王鸿利。三个遗传性异常纤维蛋白原血症家系的表型和基因型分析。 中华血液学杂志. 2011, 32:153-157.
2.        欧阳琦,丁秋兰,许冠群,张利伟,戴菁,陆晔玲,王学锋,奚晓东,王鸿利。3个遗传性抗凝血酶缺陷症家系的表型和基因型关系的研究      中国输血杂志。 2011, 24: 62-367.
3.        邢志芳,王学锋,戴菁,陆晔玲,丁秋兰,许冠群,奚晓东,王鸿利。 一个遗传性凝血因子VII缺陷症家系两种新的基因突变。 中华血液学杂志 2011, 32:158-162.
 
七、造血干细胞发育和表观遗传学(刘廷析)
(一)参与造血干/祖细胞生存和自我更新能力调控的遗传学/表观遗传学调控途径
一般认为,负责动物胚胎造血的原始造血干细胞是一群自我更新(self-renewal)能力有限的短程干细胞。我们研究发现,在斑马鱼早期造血干/祖细胞中特异性表达显性负的C/ebpα蛋白可以延长这些细胞的细胞寿命,使它们能维持到胚胎定向造血阶段并进一步诱发红系造血异常,最终导致胚胎死亡。分子学证据显示,C/ebpα蛋白可以通过结合到Bmi1基因启动子区的C/EBP结合序列,使C/ebpα显性负转基因系的Bmi1表达特异性上升。在斑马鱼早期造血干/祖细胞特异性过表达Bmi1可以获得与C/ebpα显性负转基因鱼系非常相似的表型,而降低Bmi1的表达可以使C/ebpα显性负导致的异常表型基本消失,显示Bmi1基因很可能是C/ebpα蛋白的直接下游,两者共同参与了早期造血干/祖细胞的生存和自我更新能力的调控。相关工作成果今年已在国际学术期刊《Blood》上发表。 
 
(二) miRNA 在造血干细胞和巨噬细胞发育中的调控机制。
在多种肿瘤中都发现有mir-34家族的调节异常。miR-34a 和 miR-34b/c作为P53的直接靶基因,通过介导细胞凋亡、细胞周期阻滞及细胞迁移而具有肿瘤抑制特性。对这个microRNA家族的生理功能目前还知之甚少。利用斑马鱼这一模式生物,我们发现miR-34b特异性表达于发育早期前肾多纤毛细胞(MCCs)中,这群细胞被认为是原始造血前体细胞中。敲低miR-34b的功能后发现MCCs在前肾管中大量堆积。这种堆积并非由于增殖增加或凋亡、细胞命运异常引起。活体成像技术显示这种堆积主要是由于细胞迁移异常所导致。此外肾管内其他细胞的迁移也受到了影响,前肾造血也发生了异常。我们分选出这群细胞,用表达谱芯片比较了敲低前后基因表达的变化,生物信息学分析表明变化最明显的是纤毛相关的基因,realtime-RTPCR和原位杂交证实了这一结果。免疫荧光实验表明MCCs的纤毛结构发生了异常,纤毛驱动的液流速度减缓。目前我们正在寻找与纤毛功能相关的mir34b的靶基因。我们还利用锌指核酶技术对miR-142 、miR-144进行功能研究。
 
(三)应用斑马鱼前向遗传学策略筛选和识别正常和白血病肿瘤干细胞自我更新的信号转导路径。
脊椎动物的造血分为原始造血和定向造血,而定向造血干细胞则是动物体成体所有血细胞的来源。斑马鱼作为一种新兴的模式生物在研究造血方面有很大的优势,斑马鱼与哺乳动物的造血在解剖位置上是一一对应的,在分子调控机制上是高度保守的。斑马鱼的定向造血起源于背主动脉-中肾-性腺区(AGM),逐步迁移到尾部造血组织(CHT),最终迁移到斑马鱼的成体造血器官肾脏。为了研究斑马鱼定向造血干细胞起源,自我更新,迁移过程中的分子机制,我们应用ENU化学诱变技术获得斑马鱼隐性突变家系,以全胚胎原位杂交技术为筛选手段进行了一次大规模的前向遗传学筛选,对受精后36小时和5天的斑马鱼胚胎分别以runx1和c-myb为探针,筛选影响定向造血干细胞发育、自我更新以及迁移的突变株。最终经过筛选以及互补分析,我们在以runx1为探针的筛选中在200个家系中筛到了5个突变;在以c-myb为探针的筛选中在667个家系中得到了86个突变。部分突变株已经做了定位克隆并且得到了6个突变基因。

年度发表论文:

1.        Zhou T, Wang L, Zhu KY, Dong M, Xu PF, Chen Y, Chen SJ, Chen Z, Deng M, Liu TX.  Dominant-negative C/ebp{alpha} and polycomb group protein Bmi1 extend short-lived hematopoietic stem/progenitor cell life span and induce lethal dyserythropoiesis. Blood  2011; 18: 842-52.
2.        Yuan H, Zhou J, Deng M, Zhang Y, Chen Y, Jin Y, Zhu J, Chen SJ, de The H, Chen Z, Liu TX, Zhu J. (2011) Sumoylation of CCAAT/enhancer-binding protein {alpha} promotes the biased primitive hematopoiesis of zebrafish. Blood 2011; 17: 014-20.
 
八、基因芯片的研制、应用和开发(张济、王侃侃)
(一)课题组利用ChIP-Seq平台以急性早幼粒细胞性白血病(Acute promyelocytic leukemia, APL)为模型,应用各种不同的表观遗传修饰抗体进行超高通量的测序,通过对测序片段蕴涵的生物学意义的深层次分析,探讨白血病发生过程中异常表观调控机制。目前这部分研究相关的资料正在整理中。
(二)结合ChIP-seq数据平台,通过研究APL重要融合蛋白PML-RARα对其靶基因转录调控模式,了解融合蛋白导致白血病发生的相关机理。对APL中PML-RARα融合蛋白靶基因HCK的研究表明,PML-RARα可下调HCK的表达,且这种下调依赖于PU.1结合位点。ATRA对APL的治疗有非常显著的作用,它可以通过降解PML-RARAα,促进分化等途径缓解APL症状。我们的研究表明ATRA处理NB4细胞后HCK的表达升高。以往研究显示HCK主要具有癌基因的特征,而我们的研究发现HCK在APL中主要起着抑制肿瘤发生的作用。
(三)高通量的组学平台如ChIP-seq,表达谱芯片为生命科学研究注入了新的活力,同时也为海量数据的分析、信息挖掘带来了严峻的挑战,针对数据信噪比低、假阳性高等特点亟待应用技术的创新。针对组学数据本身特点,在SOM聚类方法的基础上对转录组数据进行大量实践尝试,进一步优化SOM算法,结合奇异值分解(SVD)等一系列算法实现在统计显著水平上调变基因的特异性筛选(2011 OMICS JIB)。Motif finding在ChIP-seq数据挖掘中是非常重要的一个环节。基于转录因子ChIP-seq数据分析,我们开发出de novo motif finding的工具(Automated Motif Discovery Tool , AMD),该工具无论是分析单细胞和多细胞生物ChIP-seq数据,或是在寻找存在间隙或者较长motif时都体现出很强的精确性、特异性及高效性(2011 PLoS One)。在分子网络研究方面,利用现有胚胎分化数据库构建了两个分别代表干细胞特性(hStemModule) 和分化特性(hDiffModule) 的分子网络,利用这两种网络分析转录组数据可以判断该数据来源的细胞或者组织所处的分化状态(2011BMC Systems Biology)。

年度发表论文:

1.        Fang H, Jin W, Yang Y, Jin Y, Zhang J and Wang K. An organogenesis network-based comparative transcriptome analysis for understanding early human development in vivo and in vitro. BMC Systems Biology 2011;5:108.
2.        Zou D, Yang X, Wang P, Zhu X, Yang W, Jia X, Zhang J and Wang K.  Regulation of the hematopoietic cell kinase gene by PML/RAR? and PU.1 in acute promyelocytic leukemia. Leukemia Res In press
3.        Fang H, Du Y, Xia L, Li J, Zhang J, Wang K. A Topology-Preserving Selection and Clustering Approach to Multi-Dimensional Biological Data. OMICS JIB 2011: 5:108.
4.        Jiang L, Pan X, Chen Y, Wang K, Du Y, Zhang J. Preferential involvement of both ROS and ceramide in fenretinide-induced apoptosis of HL60 rather than NB4 and U937 cells. BBRC 2011; 405:2.
 
九、感染性疾病和血液病相关基因的结构生物学研究(蒙国宇)
本课题组基本完成了结构生物学实验室和平台的第一阶段(即立足阶段)的建设,取得的标志成就包括:1)依赖现有的设备和技术,基本完成从基因到蛋白结构的解析;2)建立了包括中(包括上海光源)、英、美、欧洲的国际合作团队,利用多领域和多学科的交叉融合,对流行性疾病(特别是在革兰氏阴性菌的毒性蛋白分泌系统和病原菌与宿主结合机理方面)和血液疾病进行系统、细致的研究;3) 目前,我们已取得了一些标志性的结果,即解析了新的晶体结构(文章在撰写中)。之外,在逐步完善新技术和新平台的建设中,也本着“开放、合作”的精神制定合理的管理制度,为未来结构生物学在国家基因组学重点实验室进一步发展提供了良好的环境。研究团队组成合理,包括研究员,副研究员,博士后和在读博士生,经过近一年的科研培训,对蛋白表达、制备、纯化、结晶和结构解析等方面,在理论和实践上都形成了较深刻的认识,在团结合作方面形成了“老带青,青激发老”的喜人局面,为2011-2012 年度的第二阶段(即发展阶段)提供了坚实的基础。
(一)感染性疾病结构生物学研究:A)绿脓杆菌的发病机制。据统计,近10%的院内感染病例是由绿脓杆菌引起的。 计划通过对绿脓杆菌生物膜相关的表面蛋白和其分泌、合成通路的研究, 进一步理解绿脓杆菌的Biofilm形成机理,并以此为基础研发出抑制针对绿脓杆菌抗药性的新型抗生素 (Cai et al, 2011)。B)流感嗜血杆菌的发病机制。通过研究流感嗜血杆菌整合素的作用机制,从结构生物学的水平阐述流感嗜血杆菌与人类宿主细胞结合的机理,从而为日后研发针对该类细菌的新型的低抗药性的小分子化合物药物提供生物学的依据 (Meng et al, 2011)。C) 革兰氏阴性菌自转子分泌系统.D) 革兰氏阴性菌外膜蛋白的合成机理。
(二)血液病相关基因的结构生物学研究:依托国家重点实验室,与其他研究组充分合作,解析疾病(特别是与血液病)相关的新基因的蛋白结构和功能的关系,如PML-RARa与砷的结合、AML-ETO, NUP98-IQCG, RIG-G, RIG-I, RIG-K等基因的功能研究,为进一步阐述白血病发病原理和开展小分子药物(Structure-based drug design)的研发提供结构生物学的基础。

年度发表论文:

1.        Meng GY, Spahich N, Kenjale R, Waksman G, Geme JS. Crystal structure of the Haemophilus influenzae Hap adhesin reveals an intercellular oligomerization mechanism for bacterial aggregation. EMBO J. 2011; 30:3864-74.
2.        Cai X, Wang R, Filloux A, Waksman G, Meng GY. Structural and Functional Characterization of Pseudomonas aeruginosa CupB Chaperones. PLoS ONE 2011; 6: e16583.
 
十、肿瘤靶向治疗研究(任瑞宝)
肿瘤靶向治疗研究课题组自2011年7月1日开始建立。在过去的半年里, 5个基因敲出/敲入小鼠模型从Brandeis 大学转到瑞金医院并开始繁殖,为下一步工作打下基础。同时,我们开始了针对RAS通路的靶向抗肿瘤治疗研究。研究工作的基础及未来的计划如下。
RAS的异常激活与人类恶性肿瘤的发生发展密切相关。我们的前期研究发现,在小鼠体内表达致癌性NRAS可以引起慢性粒单性白血病样(CMML-like)或急性髓系白血病样(AML-like)的疾病。借助于这一体内动物模型,我们检验了蛋白质翻译后修饰在NRAS致白血病过程中的重要性,并率先发现棕榈酰化修饰对于疾病发生是至关重要的。此研究第一次证明了棕榈酰化修饰对于NRAS的致白血病过程是一个关键途径,提示了靶向棕榈酰化修饰的治疗可能对包括恶性血液肿瘤在内的其他RAS相关肿瘤具有很好效果。
除了直接由基因突变引起的活化,RAS还可以被一些其他致癌性突变所激活,例如活化的蛋白酪氨酸激酶BCR/ABL,EGFR,IGFR,FGFR,MET,等等。我们最近的研究显示,在细胞中缺乏棕榈酰化修饰的突变型NRAS无法定位于质膜上,但仍然具有结合GTP的能力。这一结果提示这种棕榈酰化修饰缺陷的活化型RAS在RAS信号通路中起到了显性抑制作用。为证明这一理论,我们检验了RAS棕榈酰化修饰受抑制后在BCR/ABL的致白血病过程中的作用,发现阻止RAS的棕榈酰化修饰后,可以极大地抑制BCR/ABL诱导的CML和B-ALL的发生。这些结果说明了这种活化的RAS棕榈酰化修饰缺陷在BCR/ABL信号通路中确实是一个显性负调控因子,因此RAS棕榈酰化修饰也许可以成为治疗RAS相关血液肿瘤和其他肿瘤的有效靶点。由于这种棕榈酰化修饰缺陷的突变型RAS并没有在正常造血细胞中显示出毒性作用,因此其靶向治疗的安全性应该较为乐观。
人类至少有24种棕榈酰基转移酶(palmitoyl-acyl transferases, PATs),每一种酶都显示出较高的酶-底物专一性。因此,特异性抑制RAS相关PATs活性可能是一个行之有效的治疗策略。另外,棕榈酰化修饰其他方面,如棕榈酸底物的合成过程,也可能成为治疗的靶点之一。
我们已经成功开发了可以高通量筛选RAS棕榈酰化修饰抑制剂的技术方法和路线。 为得到特异的RAS棕榈酰化抑制剂,我们将进行系统性的药物筛选,以及后期细胞生物学和生物化学实验的验证工作。
 
十一、内分泌免疫和感染性疾病基因组学研究(宋怀东)
GD(Graves’病)是一种常见的自身免疫性疾病,临床上主要体现为促甲状腺激素受体的自身抗体阳性和甲状腺功能亢进,且遗传因素在其易感性中起了重要的作用。以前的研究发现了GD的几个易感位点,包括:人类主要组织相容性复合物(MHC),细胞毒性T淋巴细胞相关基因4(CTLA4),甲状腺刺激性激素受体(TSHR),蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22基因(PTPN22)和Fc受体样3基因(FCRL3), 但对这些易感位点的重复性试验结果不尽相同。与其它多基因病相比,其患病率相对较低 (约1%),存在主效易感基因的可能性大,同时该病不同于大多数的多基因病,Graves’病是一种非数量性状的疾病,诊断上有明确客观的指标,因此是一种研究多基因病易感基因的理想的疾病模型。在过去的一年内,课题组做为中国自身免疫性甲状腺疾病遗传协作组的牵头人,总共在全国各地新收集Graves’病病人样本3,000例,使Graves病遗传资源样本库中的病例数达到12,000例,同地区的正常样本15,582例,已经建立了国际上最大的Graves病的样本库。
我们对中国汉族GD人群(1536例GD病例和1516例正常对照)进行了全基因组关联分析,并在3994例GD病人和3510例正常对照中对其中的100个P值差异明显的SNPs位点进行了验证。关联分析结果显示:以前已经报道的四个GD易感基因,即MHC, TSHR, CTLA-4 和 FCRL3基因,与中国汉族人甲亢的发生密切相关,同时我们的研究还发现了两个新的GD易感区段:分别是6q27一个包含易RNASET2-FGFR1OP-CCR6 三个基因的高度连锁的区段(rs9355610位点)和4p14基因间区域(rs6832151位点)。同时功能实验提示在外周血单个核细胞中6q27区段的rs9355610易感等位基因可以使RNASET2基因的表达下降,且这种表达的下调主要体现在CD4+和CD8+的细胞亚群中。在4p14区域我们根据已报道的ESTs首次克隆了一个新的基因,并命名其为GDCG4p14基因;且功能实验提示在外周血单个核细胞中rs6832151易感等位基因可以下调GDCG4p14基因的表达,且主要体现在CD8+细胞亚群中。两个新位点的候选基因的功能提示可能有新的分子通路参与了GD的发生。
临床亚型的关联分析结果显示,TSHR和MHC II类分子的SNP位点和甲状腺刺激激素受体自身抗体(TRAb)持续阳性的甲亢病人相关,而MHC I类分子的SNP位点和TRAb抗体非持续阳性的GD病人相关。表明这两类甲亢病人可能有不同的发病机制。众所周知,抗甲状腺药物(ATD)治疗后,TRAb持续阳性,是停药后复发的一个重要的预测指标。因此,对这些位点内SNP的分析,有可能为甲亢治疗方法的选择和预后的评估提供重要的参考依据。
以上研究结果已发表在2011年的《自然遗传学》杂志。

年度发表论文:

1.        Chu X, Pan CM, Zhao SX, Liang J, Gao GQ, Zhang XM, Yuan GY, Li CG, Xue LQ, Shen M, Liu W, Xie F, Yang SY, Wang HF, Shi JY, Sun WW, Du WH, Zuo CL, Shi JX, Liu BL, Guo CC, Zhan M, Gu ZH, Zhang XN, Sun F, Wang ZQ, Song ZY, Zou CY, Sun WH, Guo T, Cao HM, Ma JH, Han B, Li P, Jiang H, Huang QH, Liang L, Liu LB, Chen G, Su Q, Peng YD, Zhao JJ, Ning G, Chen Z, Chen JL, Chen SJ, Huang W, Song HD; China Consortium for Genetics of Autoimmune Thyroid Disease. A genome-wide association study identifies two new risk loci for Graves' disease. Nat Genet. 2011; 43:897-901.
2.        Qiao J, Han B, Liu BL, Liu W, Wu JJ, Pan CM, Jiang H, Gu T, Jiang BR, Zhu H, Lu YL, Wu WL, Chen MD, Song HD. A unique exonic splicing mutation in the CYP17A1 gene as the cause for steroid 17{alpha}-hydroxylase deficiency. Eur J Endocrinol. 2011;164:627-33.